堀越氏芽孢桿菌S184產河豚毒素的發酵條件優化

陸燕, 易瑞灶, 陳偉珠

(國家海洋局第三海洋研究所,福建廈門 361005)

堀越氏芽孢桿菌S184產河豚毒素的發酵條件優化

陸燕, 易瑞灶, 陳偉珠

(國家海洋局第三海洋研究所,福建廈門 361005)

采用快速有效的數學統計方法對堀越氏芽孢桿菌(B acillus horikoshii)S184產河豚毒素的發酵條件進行了優化。利用Plackett-Burman設計,從眾多影響產河豚毒素的因素中篩選出影響較大的3個因素:蛋白胨、磷酸鹽質量濃度和接種體積分數。在此基礎上,再利用響應面法中的雜合設計進行優化,通過擬合得到響應曲面函數,并獲得了最佳的實驗條件。在該實驗條件下,河豚毒素產量從666.65 ng/L提高到1 900.60 ng/L。

優化;河豚毒素;Plackett-Burman設計;雜合設計

河豚毒素(TTX)是一種毒性很強的海洋生物活性物質,為非蛋白質類神經毒素,其分子中胍氨基是活性部位,胍氨基在生理條件下通過質子化形成正電活性區域,與神經和肌肉細胞膜表面的Na+通道上的專一性受體蛋白質的負電性羥基結合,其周圍羥基以氫鍵形式與受體結合,這樣Na+通道被阻滯,從而影響神經肌肉間興奮性的傳導[1-3]。它是神經生物學和生理學研究不可替代的工具藥,并已投入臨床使用。除此之外,TTX還具有降血壓、抗心律失常、緩解痙攣、鎮痛、局部麻醉等多種療效。尤為重要的是,它在用于抑制癌癥劇痛和戒毒時,具有用量少、持效時間長且用后不成癮的優點,因而具有很大的開發利用價值。

目前,國內外所用的TTX大多是從河豚魚內臟中提取的,這使得河豚魚資源日益稀少,藥源供應受到限制。而多種產TTX微生物的發現[4-6],為TTX的生產提供了一個很好的潛在替代資源。作者所在實驗室在前期研究中篩選到了一株堀越氏芽孢桿菌S184[7]。針對TTX產量低的問題,作者先用Plackett-Burman設計對影響菌株S184產TTX的諸多因素進行考察,從中篩選出最為重要的因素,再用雜合設計對此進行優化。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株堀越氏芽孢桿菌(B acillus horikoshii) S184,為作者在前期研究中篩選得到[7]。

1.2 初始培養基和培養條件

種子培養基和發酵培養基均為Zobell 2216E液體培養基,初始p H值為7.5。由平板挑取單菌落接入種子培養基,200 r/min培養24 h。將種子液按體積分數5%接入發酵培養基,28℃、200 r/min培養24 h。以裝液量20%為基準,進行培養基組成和培養條件的優化實驗。

1.3 發酵液中TTX的分離純化

發酵結束后,8 000 r/min離心15 min,上清液用醋酸調p H 4.0,旋轉蒸發濃縮約10倍,沸水浴10 min,8 000 r/min離心30 min,去除沉淀。上清液過活性炭柱,用1%醋酸(20%乙醇配制)洗脫,收集洗脫液,40°C減壓濃縮,去除乙醇,留下濃縮液少許,過SEP PA K C18小柱,用適量0.03%醋酸洗脫,洗脫液冷凍干燥,溶于少量0.03%醋酸,用于檢測。

1.4 TTX含量測定

儀器:Waters 2695,配有Waters 2475熒光檢測器;柱子:ZORBAX SB-C8柱(4.6 mm×250 mm, 5μm,Agilent);流動相:0.05 mol/L Na2HPO4, 0.05 mol/L NaH2PO4,2.5 mmol/L庚烷磺酸鈉;流速0.3 mL/min;柱后衍生試劑為4 mol/L NaOH;衍生化溫度110℃;檢測波長:激發波長365 nm,發射波長510 nm。

1.5 實驗設計

作者以TTX產量為響應目標,采用兩步法進行優化。首先利用Plackett-Burman設計篩選出對響應影響較大的因素,然后用響應面法進行優化,通過實驗數據擬合,最終確定最優實驗條件。

1.5.1 篩選實驗—Plackett-Burman設計 Plackett-Burman設計由Plackett和Burman于1946年提出,它建立在不完全平衡板塊原理的基礎上,通過N個實驗至多可以研究(N-1)個變量(N一般為4的倍數)[8]。每個變量有高、低兩個水平,分別以+、-標記。

作者考察8個因素,選用N=12的Plackett-Burman設計,實驗安排見表1。每一行代表一次實驗,每一列表示一個考察的因素。各參數代表的變量及高低水平對應的真實值見表2。

表1 N=12的Plackett-Burman實驗設計與結果Tab.1 Experimental design of Plackett-Burman with TTXconcentration as response

表2 Plackett-Burman設計的因素和水平Tab.2 The values of variables chosen for study versus the coded values of Plackett-Burman

1.5.2 優化實驗 響應曲面法是數學方法和統計方法相結合的產物,它充分考慮了各個變量的交互作用,因此可以用來對人們感興趣的受多個變量影響的響應問題進行建模與分析,并可以將該響應進行優化。雜合設計是由Roquemore[9]于1976年提出的,這種設計可以通過最少的實驗來擬合二階的響應面模型,前幾個因素具有5個水平,最后一個因素具有4個水平。

作者采用的雜合設計是Roquemore提出的R310型的設計,具體設計方案見表3,各水平對應的變量真實值見表4。

1.5.3 驗證實驗 通過對優化實驗部分得到的多元函數進行性狀分析,在有效范圍內得到其極值點,再按照該參數進行實驗,以驗證模型的可靠性,并確定優化結果。

表3 雜合實驗設計矩陣及TTX質量濃度的實驗值和預測值Tab.3 Matrix for hybrid design with experimental and predicted values of TTXconcentration

表4 雜合設計各變量的高低水平對應的真實值Tab.4 Actual values of variables versus coded values of hybrid design

2 結果與分析

2.1 影響菌株S184產TTX能力的重要因素的篩選

影響菌株S184發酵產TTX能力的因素有很多,主要有培養基的組成、p H值、NaCl質量濃度、磷酸鹽質量濃度、接種體積分數、裝液量、發酵溫度等,其中,培養基的組成和p H值可直接影響細菌的生長和代謝;磷酸鹽的存在可影響細菌產TTX的能力,高質量濃度的磷酸鹽抑制TTX的產生;由于菌株來源于海洋中的河豚魚,鹽質量濃度會影響TTX的產生;接種量對菌體的生長有一定的影響;搖瓶中的供氧能力與裝液量密切相關,而不同的溶氧條件會影響菌株的代謝途徑,從而影響TTX的產量。鑒于以上分析,作者確定了包括蛋白胨、酵母提取物、p H值、NaCl質量濃度、磷酸鹽質量濃度、接種量、裝液體積分數、發酵溫度等8個影響因素,選用N=12的Plackett-Burman設計。按Plackett-Burman設計進行二輪實驗,發酵結束后對發酵液中TTX進行分離純化,測定TTX質量濃度,取二次測量值的平均值。分別計算各因素效應,結果見表5。

表5數據顯示:蛋白胨質量濃度、磷酸鹽質量濃度和接種體積分數對菌株S184產TTX能力影響較明顯。因此,在后面的優化實驗中,將對這3個因素進行進一步優化。

根據效應的正負,其它因素確定為:NaCl 1 g/dL,酵母提取物0.1 g/dL,起始p H 7.5,裝液量20%,發酵溫度20℃。

表5 Plackett-Burman設計的效應Tab.5 Effect estimates on TTXconcentration from results of Plackett-Burman design

2.2 響應面的擬合以及最佳產TTX條件的確定

在篩選實驗中,選出了3個待優化的參數,采用雜合設計的實驗方法僅需要10次實驗即可完成優化實驗,并可對響應曲面函數進行擬合。

由SAS數據統計軟件進行擬合,得到二次響應曲面函數為:

其中:X1、X2、X3分別代表蛋白胨質量濃度、磷酸鹽質量濃度和接種量的編碼值。對模型的方差分析結果見表6。模型對實際情況擬合很好,因此可以用方程(1)對菌株S184發酵產TTX的能力進行分析和預測。

表6 菌株S184發酵產TTX量的方差分析和回歸分析Tab.6 ANOVA and regression analysis for TTX production by S184

用SAS軟件優化條件組合,得到Ymax= (1.736,-2.2E-16,-0.9273)=1 900.55。與此對應的真實值是:蛋白胨質量濃度0.747 2 g/dL,磷酸鹽質量濃度0.006 g/dL,接種體積分數1.145 4%,可使TTX產量達到最高。

2.3 擬合優化的驗證

根據篩選實驗中確定的參數條件以及擬合優化得到關鍵參數的最佳實驗條件,確定了菌株S184產TTX的最佳條件為:蛋白胨0.747 2 g/dL,NaCl 1 g/ dL,酵母提取物0.1 g/dL,磷酸鹽0.006 g/dL,起始pH 7.5,裝液量20%,接種體積分數1.145 4%,發酵溫度20℃。在該條件下,模型預測TTX產量為1 900.55 ng/L,實際測得為1 900.60 ng/L。

而初始條件下Y(0.5,2,1),即蛋白胨0.5 g/dL,磷酸鹽0.01 g/dL,接種體積分數5%時,模型預測TTX產量為666.23 ng/L,實際測得666.65 ng/L。可見該模型能較好地預測菌株S184產TTX的實際情況。優化后的TTX產量比初始條件下提高了1.85倍。

3 結 語

常用的優化手段(如單因素優化法),往往忽略了各影響因素的交互作用,難以得到理想的優化結果[10]。而當考察因素較多時,實驗次數也會隨之大增。作者采用的Plackett-Burman設計,是建立在不完全平衡板塊原理的基礎上,可以從眾多因素中快速、有效地篩選出最為重要的因素。近年來,該方法已被廣泛應用于發酵條件的優化[11-13]。而響應面法中的雜合設計能以最經濟的方式,以最少的實驗對實驗條件進行全面研究,使優化后的TTX產量比初始條件下提高了1.85倍,達到了預期目標。但是,要實現TTX的規模化發酵生產,其產量還有待進一步提高。因此,在今后的工作中,必須對菌種進行合理的高產育種,并深入研究TTX的生物合成機理,以便通過改變代謝途徑中各種酶的活性來提高TTX的產量。

[1]Kirsch G E,Shieh C C,Drewe J A,et al.Segmental exchanges define 4-aminopyridine binding and the inner mouth of K+pores[J].Neuron,1993,11:503-512.

[2]Scholz A,Vogel W.Tetrodotoxin-resistant action potential in dorsal root ganglion neurons are blocked by local anesthetics[J].Pain,2000,89:47-52.

[3]Narahashi T.Pharmacology of tetrodotoxin[J].J Toxicol-Toxin Rev,2001,20:67-84.

[4]Lee M,Jeong D,Kim W,et al.A tetrodotoxin-producing Vibrio strain,LM-1,from the puffer fishFugu vermicularis radiatus[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(4):1698-1701.

[5]Yu C F,Yu P H F,Chan P L,et al.Two novel species of tetrodotoxin-producing bacteria isolated from toxic marine puffer fishes[J].Toxicon,2004,44:641-647.

[6]Wang XJ,Yu R C,Luo X,et al.Toxin-screening and identification of bacteria isolated from highly toxic marine gastropodN assarius semiplicatus[J].Toxicon,2008,52:55-61.

[7]陸燕,易瑞灶.河豚魚體內產河豚毒素海洋細菌菌株的篩選[J].福建師范大學學報:自然科學版,2008,24(Sup):179-181.

LU Yan,YI Rui-zao.Screening of tetrodotoxin-producing marine bacteria isolated from puffer-fish[J].Journal of Fujian Normal University:Natural Science Edition,2008,24(Sup):179-181.(in Chinese)

[8]Plackett R L,Burman J P.The design of optimum multifatorial experiments[J].Biometrika,1946,37:305-325.

[9]Roquemore K G.Hybrid designs for quadratic response surfaces[J].Technometrics,1976,18(4):419-423.

[10]Haaland P D.Statistical problem solving[M].New York:Marcel Dekker,1989:1-18.

[11]白東棟,吳堅平,徐剛,等.響應面法優化烯丙醇酮乙酸酯水解酶的產酶條件[J].食品與生物技術學報,2007,26(1): 71-76.

BAI Dong-dong,WU Jian-ping,XU Gang,et al.Optimization of the production conditions of HMPC hydrolase employing response surface methodology[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2007,26(1):71-76.(in Chinese)

[12]Reddy L V A,Wee YJ,Yun J S,et al.Optimization of alkaline protease production by batch culture ofBacillussp. RKY3 through Plackett-Burman and response surface methodological approaches[J].Bioresource Technology,2008,99: 2242-2249.

[13]Lu Y,Mei L H.Optimization of fermentation conditions for P450 BM-3 monooxygenase production by hybrid design methodology[J].Journal of Zhejiang University Science B,2007,8(1):27-32.

(責任編輯:李春麗)

Enhancement Tetrodotoxin Production fromBacillus horikoshiiS184 by Optimizing Nutrient and Environmental Conditions

LU Yan, YI Rui-zao, CHEN Wei-zhu
(Third Institute of Oceanography,State Oceanic Administration,Xiamen 361005,China)

In this manuscript,factorial design and response surface techniques were used to design and optimize the nutrient and environmental conditions for tetrodotoxin production fromB acillus horikoshiiS184.The content of peptone and phosphate,inoculum has been identified as three significant parameters for tetrodotoxin production by Plackett-Burman design.Based on those results,the optimum conditions were achieved by response surface techniques.With the optimum conditions,the yield of tetrodotoxin was increased to 1 900.60 ng/L from 666.65 ng/L.

optimization,tetrodotoxin,Plackett-Burman design,hybrid design

Q 93

:A

1673-1689(2010)02-0307-05

2009-07-01

福建省青年人才基金項目(2007F3059);國家海洋局第三海洋研究所專項資金項目(海三科2007014)。

陸燕(1978-),女,江蘇江陰人,工學博士,助理研究員,主要從事生物化工與發酵工程方面的研究。Email:hyss.yanlu@163.com