山楂葉和果中類SOD的提取與研究

張?zhí)m杰, 辛廣, 楊琳

(鞍山師范學院化學系,遼寧鞍山 114007)

山楂葉和果中類SOD的提取與研究

張?zhí)m杰, 辛廣, 楊琳

(鞍山師范學院化學系,遼寧鞍山 114007)

實驗對山楂葉、果中類SOD(Superoxide disutase like簡稱SOD-L)進行了提取與研究。通過連苯三酚自氧化法對山楂葉、果中SOD-L活性進行分析,測得山楂葉提取物中SOD-L的活力為630.14 u/mg;山楂果提取物中SOD-L的活力為252.05 u/mg;在280 nm有特征性吸收峰;在Mg2+和Cu2+的存在時SOD-L的活性有著不同程度的增強。SOD-L的最適溫度在40℃;最適p H值在8.0。

山楂葉;山楂果;SOD-L;抗氧化性

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, EC.1.15.1.1,SOD)是一類廣泛存在于各類生物體內(nèi)的氧化還原酶,至1969年由McCord和Fridovich[1]發(fā)現(xiàn)此酶以來,有關(guān)SOD在生物界的分布及特性的研究倍受重視。近年來,人們對具有SOD同樣功能而非SOD的一類化合物進行了大量研究,這類化合物稱為SO-L(Superoxide dismutase like簡稱SOD-L),其清除O2-的作用稱為SOD-L活性(SOD-Like Activity)。目前,SOD-L活性已經(jīng)成為抗衰老藥物和保健食品的一個重要指標[2]。

山楂為薔薇科山楂屬(Crataegus.L)植物,在我國具有悠久的保健與藥用歷史。

自20世紀50年代,人們開始對山楂葉、果的化學成分進行了研究[3-6],證明其含有大量的黃酮以及綠原酸、山楂酸、膽堿、揮發(fā)油等。但對山楂葉、果中的黃酮類物質(zhì)具有SOD-L活性未見報道,我們采用鞍山地區(qū)盛產(chǎn)的野生山楂葉、果,用連苯三酚自氧化法,測定其SOD-L活性,并對其部分性質(zhì)進行了研究,旨在為山楂葉、果的進一步利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

山楂葉、果:采自千山鄉(xiāng)摩云山,由鞍山林業(yè)所孫忠誠教授鑒定;連苯三酚:分析純,貴州遵義化學試劑廠產(chǎn)品,用0.01 moL HCl配制成50 mmol的連苯三酚溶液;三羥甲基氨基甲烷:分析純,沈陽市醫(yī)藥公司化玻站試劑,配制成p H值8.2;50 mmol Tris-HAc緩沖液;p HS-3C型數(shù)字酸度計:上海精密科學儀器有限公司;U-1810紫外可見光分光光度計:北京普析通用儀器有限責任公司。

2 實驗方法

2.1 山楂葉、果中SOD-L的提取

取烘干、粉碎的山楂葉、果各50 g放入索氏提取器中,加入乙醚,回流至無色,回收乙醚,然后用體積分數(shù)70%乙醇加熱提取6 h,濃縮后,用乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,再經(jīng)大孔吸附樹脂AB-8進行分離純化、減壓濃縮、干燥,得粉末狀SOD-L。精密稱取SOD-L 50 mg,用雙蒸水配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL水溶液待用。

2.2 SOD-L活性的測定

2.2.1 連苯三酚自氧化速率的測定 采用謝衛(wèi)華等人的方法[7]略有改動。取兩支干燥、潔凈的試管,一支為空白對照管,另一支為測定管,分別在兩支試管中加入p H值為8.2;50 mol/L MTris-HAc緩沖液3 mL,混勻置于25℃的恒溫水浴中20 min,然后在測試管中加入7μL的連苯三酚,加入瞬間開始計時,用U-1810紫外可見光分光光度計,測定波長為325 nm,以對照管調(diào)零,記錄測定管的吸光度A0,換算ΔA0=0.070/min,ΔA0的值為每分鐘連苯三酚自氧化速率的吸光度。

2.2.2 SOD-L活性的測定 取兩支試管加入50 mmol/L Tris-HAc緩沖液3 mL,在測試管中加入適量的SOD-L待測液,置于25℃的恒溫水浴中保溫20 min,然后在測定管中加入7μL的連苯三酚,加入瞬間開始計時,以對照管調(diào)零,記錄測定管的吸光度A1,換算ΔA1=0.034/min,ΔA1的值為每分鐘SOD-L吸光度。

SOD-L的活性按下式計算:

式中ΔA0為連苯三酚的自氧化率,ΔA1為加入待測液后連苯三酚的自氧化率。

3 結(jié)果與討論

3.1 山楂葉果中SOD-L的紫外吸收光譜

將精制的SOD-L溶液,與HCl-Mg,AlCl3,Pb (Ac)3反應(yīng)均為陽性,表明其中含有黃酮類化合物。將蘆丁標準液及山楂葉、果SOD-L稀釋,在240～350 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描,其最大吸收峰都在280 nm,如圖1。以蘆丁作標準品,制作工作曲線,測定其黃酮類化合物的純度達到95.56%。

圖1 山楂葉、果中SOD-L及蘆丁標準液的紫外吸收光譜Fig.1 Absorption spectrometry of SOD-Like in hawthorn leaves and fruit

3.2 山楂葉、果中SOD-L的活性測定

3.2.1 測定光譜的選擇 在3 mL的緩沖液中,加入7μL連苯三酚,溶液由無色變成淡黃色,隨后再變成淡綠色,最后轉(zhuǎn)變?yōu)樯铧S色,經(jīng)測定在325 nm處有最大吸收峰如圖2所示。

圖2表明其在325 nm和420 nm均有吸收峰, 325nm處的吸收峰隨放置時間延長而迅速增高,24 min以后,吸收峰開始降低,420 nm處的吸收峰則是緩慢增高,這與連苯三酚自氧化生成的中間產(chǎn)物不斷氧化有關(guān)。文獻[8]報道的連苯三酚自氧化法中檢測波長不盡相同,根據(jù)檢測結(jié)果對325 nm和420 nm波長進行比較結(jié)果表明:波長為325 nm時,吸光度值比較大。在3 mL的緩沖液中加入山楂葉、果SOD-L溶液,然后再加入連苯三酚,經(jīng)測定在325nm處仍有最大吸收峰,說明兩種SOD-L的加入對最大吸收峰的波長沒有改變,故可選擇325 mn為測定波長。

圖2 連苯三酚325 nm的吸收峰Fig.2 Peak of even phloroglucinol in 325 nm

3.2.2 SOD-L的活性測定 在堿性條件下(p H值8.20),連苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng),生成O2-和有色中間產(chǎn)物,該有色中間產(chǎn)物在λ=325 nm處有—特征性吸收峰。當加入山楂葉、果SOD-L時,O2-的生成受到抑制,連苯三酚自氧化過程受阻,溶液在λ =325 nm處吸收減弱。故通過測定A325可以推斷山楂葉、果SOD-L的活性。結(jié)果表明:山楂葉SOD-L的活性為630.14 u/mg;山楂果SOD-L的活性為252.05 u/mg,山楂葉中的SOD-L含量是山楂果中的2.5倍。

3.3 山楂葉、果中SOD-L的性質(zhì)

3.3.1 不同p H值對山楂葉、果SOD-L活性的影響在25℃條件下,分別配制0.05 mol/L,p H值為3.0～12.0緩沖溶液,用連苯三酚自氧化法測定不同p H條件SOD-L對O2-的抑制率。結(jié)果表明:山楂葉、果SOD-L的最適p H在8.0左右,p H值穩(wěn)定范圍在6.0～10.0之間,其結(jié)果見表1。

表1 不同緩沖液pH值對SOD-L活性的影響Tab.1 Influence of SOD-Like competence at different buffer solution pH

3.3.2 Mg2+,Cu2+,Fe2+對山楂葉、果SOD-L的影響 配制濃度為0.005 mol/L的MgCl2、CuCl2和FeCl2溶液與一定濃度的山楂葉、果的SOD-L液混合,在25℃、p H值8.2條件下,測定不同離子對O2-的抑制率。分別用0.005 mol/L、50μL MgCl2、GuCl2和FeCl2與一定濃度的山楂葉、果中SOD-L混合,在25℃條件下測定不同離子對SODL活性的影響,結(jié)果表明Mg2+、Cu2+對山楂葉、果中SOD-有一定的激活的作用,對Fe2+則不敏感,實驗結(jié)果見表2。

表2 Mg2+,Cu2+,Fe2+對山楂葉、果中SOD-L的影響Tab.2 Effect Mg2+,Cu2+,Fe2+on SOD-L activity in hawthorn leaves and fruit

3.3.3 不同溫度對山楂葉、果SOD-L活性的影響

以牛血SOD為對照,測定不同溫度條件下,山楂葉、果SOD-L對O2-抑制率的影響,結(jié)果見表3。實驗表明:山楂葉、果SOD-L的最適溫度在40℃左右,與牛血SOD的最適溫度相類似。當溫度達60℃時,其SOD-L對O2-抑制率略有下降,溫度提高到80℃,其對O2-抑制率為原初抑制率的80.36%。而在同樣溫度條件下,牛血SOD對O2-抑制率僅保留30.21%左右。可見山楂葉、果SOD-L所表現(xiàn)出的活性比牛血SOD有著更高的熱穩(wěn)定性。

表3 不同溫度對山楂葉、果SOD-L的影響Tab.3 Effect of different temperature on SOD-L activity in hawthorn leaves and fruit

4 結(jié) 語

實驗表明:山楂葉、果SOD-L與牛血SOD在清除自由基方面有著相同的作用,在紫外吸收光譜上也表現(xiàn)出與牛血SOD的類似特征。在一定濃度Mg2+、Cu2+存在時,山楂葉、果SOD-L對O2-具有較強的抑制作用,而對Fe2+的存在表現(xiàn)不敏感;它們對溫度的穩(wěn)定性則優(yōu)于SOD,筆者認為這是由于其化學組成和分子結(jié)構(gòu)不同于酶蛋白分子所造成的,對其機理的研究,有待于進一步探討。

山楂葉、果SOD-L主要是黃酮類化合物,它是一類具有廣泛生物活性、低分子的植物次生代謝物。一些研究已證明,SOD具有清除O2-的能力,作為靶標具有選擇性殺死腫瘤細胞的作用[9],但它是大分子的蛋白質(zhì)且在體內(nèi)半衰期短,使其應(yīng)用受到一定的限制。而黃酮類物質(zhì)同樣具有清除O2-的效果[10],利用黃酮SOD-L性質(zhì)及波譜學特征,來篩選具有良好抗氧化作用的天然藥物具有實際意義。鞍山地區(qū)山楂葉、果的資源十分豐富,為廉價的天然抗氧化劑的制備提供了優(yōu)越的條件。

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(責任編輯:楊萌)

Extraction and Characteristics of Superoxide Disutase from H awthorn Leaves and Fruit

ZHANG Lan-jie, XIN Guang, YANG Lin
(114007,China)

The manuscript described the extraction of the category SOD-L in hawthorn leaves and fruit.This experiment extract and analysis is through using pyrogallol since the oxidation of hawthorn in leaves and fruit category SOD-L,we measured extract of SOD-L vigor in hawthorn leaves and fruit was 630.14 u/mg and 252.05 u/mg,respectively.SOD-L in the bran has a typical absorption at 280 nm.And it was found that the activity of SOD increase with the presence of Mg2+,Cu2+.SOD-Lactivity of hawthorn in leaves and fruit in the bran had an obvious optimum stability at the condition of 40℃and p H 8.0.

hawthorn leaves,hawthorn fruit,Superoxide disutase like,Anti-oxidation

TS 2

:A

1673-1689(2010)01-0077-04

2008-12-25

遼寧省教育廳科學研究計劃資助項目(200502)。

張?zhí)m杰(1957-),女,遼寧鞍山人,教授,主要從事生物化學的教學與科研。Email:zhanglanjieas@ 163.com。