葡萄感染霜霉病菌后幾種信號物質的變化

林志強, 李希東, 侯麗霞, 張英昊, 劉 新

(青島農業大學生命科學學院,青島 266109)

葡萄感染霜霉病菌后幾種信號物質的變化

林志強, 李希東, 侯麗霞, 張英昊, 劉 新*

(青島農業大學生命科學學院,青島 266109)

以3個抗病性不同的釀酒葡萄品種(‘西拉’＞‘霞多麗’＞‘赤霞珠’)葉片為材料,檢測霜霉病菌侵染后幾種病原相關信號物質,如脫落酸(ABA)、過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、茉莉酸(JA)和乙烯(ETH)等的變化,以探討葡萄抵御霜霉病菌的信號轉導機制。結果表明,H2O2和NO是葡萄感應霜霉病菌的早期信號分子,且抗性較強的品種‘西拉’的變化最為明顯;JA和ABA是抗性較差品種‘赤霞珠’應答霜霉病的信號組分。而3個抗性不同葡萄品種的乙烯變化無明顯差別。推測H2O2、NO、JA和ABA均參與了葡萄對霜霉病菌的防御反應,但不同品種間信號轉導組分可能存在差異。

葡萄; 霜霉病; 信號物質; 抗病性

由葡萄霜霉病菌[Plasmoparaviticola(Berk.etCurtis)Ber.etde Toni]引起的葡萄霜霉病(grape downy mildew)是葡萄生產中最嚴重的真菌病害之一[1-2]。在釀酒葡萄的栽培和生長過程中極易發生,嚴重影響著植株的生長和果實的產量及品質,進而也大大制約了葡萄酒的產量和品質[3]。因此,選育抗霜霉病的葡萄品種,研究其致病機理和抗病機制成為農業科學工作者的一項重要任務。

不同葡萄品種對霜霉病菌的抗性存在著明顯的差異,沙月霞等發現不同葡萄品種對霜霉病菌的抗性表現出明顯差異,‘白比諾’(‘Pinot Blanc’)抗性最強,‘品麗珠’(‘Cabernet France’)抗性最弱[4]。研究表明,植物感病后會發生過敏反應、胼胝質的加厚、保護酶含量的升高、病程相關蛋白的表達等早期的防衛反應以抵御霜霉病菌的侵染,一氧化氮(NO)、過氧化氫(H2O2)、水楊酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、脫落酸(abscisic acid,ABA)和乙烯(ethylene,ETH)等信號物質參與此過程[5-8]。NO和H2O2可協同作用提高苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)和幾丁質酶(chitinase)等保護酶的活性,參與番茄對黑色根霉菌的防御反應[9]。據報道,病原菌侵染會引起植物體內源激素含量變化,進而激活植物防御反應基因的表達[10]。外施茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me-JA)能夠有效地控制采后綠熟期番茄果實根霉果腐病癥狀的發展,同時提高了番茄果實中苯丙氨酸解氨酶、幾丁質酶和β-1,3葡聚糖酶的活性[11];利用外源 ABA生物合成抑制劑氟啶草酮(fluridone)和氟草敏(norflurazon)以及ABA缺失突變體等研究發現,增加ABA含量能提高植物對病菌的敏感性[12];葡萄在感染病原菌早期會產生大量乙烯,外施乙烯利(ethephon)增加與致病相關的CH IT4c,PIN,PGIP和GLU等蛋白基因表達和提高了葡萄對白粉病的抗性[13]。但目前有關葡萄受到霜霉病菌侵染后ABA、H2O2、NO和JA等內源信號物質變化的研究鮮有報道。

NO、H2O2、ABA、JA 和乙烯參與多種植物的不同防御反應,那么它們是否與葡萄抵抗霜霉病有關?在霜霉病菌侵染葡萄葉片的過程中其變化怎樣?本研究通過檢測抗性不同葡萄品種葉片在受到霜霉病菌侵染后NO、H2O2和ABA等內源信號物質的變化,力圖尋找與抗病相關的信號物質,為進一步探明霜霉病的抗病機制、選育抗性釀酒葡萄栽培品種和病害防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

葡萄霜霉病菌采自青島農業大學生命科學學院葡萄實驗基地‘霞多麗’發病葉片。

1.2 供試品種

3個主栽釀酒葡萄品種:‘赤霞珠’(‘Cabernet Sauvignon’)、‘西拉’(‘Syrah’)和‘霞多麗’(‘Chardonnay’)。

1.3 病情調查及病情指數計算

病情分級標準[4]:0級,全葉無病斑;1級,病斑占葉片總面積≤5%;2級,5%＜病斑占葉片總面積≤25%;3級,25%＜病斑占葉片總面積≤50%;4級,50%＜病斑占葉片總面積≤75%;5級,病斑占葉片總面積75%以上,或葉片枯死。

病情指數=[∑(受害級別×該級葉片數)/總葉數×最重發病級別代表數]×100。

1.4 田間霜霉病病情調查

分別于2008年8月下旬至9月底,對煙臺蓬萊中糧君頂酒莊3個葡萄品種進行了霜霉病的田間調查,統計病葉率和按照上述分級標準計算病情指數。每株任意選取一個新梢,調查整個新梢葉片的感病性,每個小區每個品種調查100個葉片左右,調查7個小區。

1.5 孢子囊接種濃度的選擇

1.5.1 病原菌的采集與繁殖

從田間‘霞多麗’葡萄品種上采回霜霉病葉片,清水沖去舊孢子囊,于20℃和相對濕度100%下培養24 h,待新孢子囊長出后,用毛刷刷下孢子囊,無菌水配制成 2×104、4×104、8×104個/mL和 16×104個/mL孢子囊懸浮液。接種前用載玻片萌芽法測定孢子囊生活力,萌芽率85%以上為有效。

1.5.2 霜霉病菌的接種

采取健康無病的盆栽葡萄植株一年生枝條3～6葉位葉片,用0.1%升汞消毒2 min,無菌水沖洗數次后,用打孔器制成直徑1 cm的葉碟,每個品種100片左右,平均分成3份,每個品種各取1份作為一個處理,3次重復,葉背向上平放在濕度為100%的培養基上,用微量移液器進行接種,每個葉片接種30 μ L。將培養皿置20℃培養箱中,7 d后統計發病情況,計算病情指數。

1.6 室內離體葉片接種鑒定

每個品種取3～6葉位葉片100片左右,以8×104孢子囊/mL的菌液對3個品種的離體葉片進行噴霧接種,置于濕度100%、溫度20℃的培養箱中培養,3次重復,7 d后統計發病情況并計算病情指數。

1.7 葡萄葉片內源信號物質含量測定

1.7.1 處理

以孢子囊濃度8×104個/mL的菌液對3個不同葡萄品種盆栽的3～6葉位健康葉片背面進行噴霧接種,套袋保濕24 h,按上述分級標準采集3個葡萄品種感染霜霉菌的各級葉片。每個病級采集20個葉片,液氮迅速冷凍后,將葉片敲碎混勻用于試驗。

1.7.2 NO含量的測定

用NO試劑盒測定(南京建成生物工程研究所)。取0.1 g處理過的葉片加0.9 mL 0.9%NaCl,勻漿;離心,取上清,沸水浴 5 min;12 000 g離心5 min,取上清,稀釋 10倍,在 550 nm 波長下,測定吸光度值,計算出組織中的NO水平。對照和處理都是3次重復的平均值和標準誤差。

1.7.3 H2O2含量的測定

參照郝再彬等[14]的方法,取葉片,加預冷丙酮研磨成漿;離心,取上清,依次加入硫酸鈦和濃氨水;5 000 r/min離心10 min后棄上清,洗滌5次,用硫酸溶解沉淀,在415 nm波長下,測定吸光度值。對照和處理都是3次重復的平均值和標準誤差。

1.7.4 ABA和JA含量的測定

取0.3 g接種處理過的葉片,加1.5 mL 80%甲醇,勻漿;ELISA法測定ABA和JA含量[15],試劑盒購自中國農業大學化控研究室。

1.7.5 乙烯釋放量的測定

每個病級都選取葉位和質量相同的2個葡萄葉片,放于100 mL三角瓶中,用3層封口膜將瓶口封好,在20℃下,放置4 h。由瓶內取氣1 mL注入GC-2010氣相色譜儀測定乙烯含量。氣相色譜儀載氣為高純氮氣,流速38.7 mL/min,載氣溫度為150℃;氫火焰離子檢測器 FID,檢測室溫度為200℃,氣譜柱為GDX-502填充柱,內徑0.53 mm,薄膜厚度1.00 μ m,柱長10 m,柱溫80 ℃。乙烯釋放量速率以每克鮮重每小時生成的nmol數表示,每個樣品重復3次。

1.8 數據統計方法

測定結果用DPS數據處理系統作方差分析。

2 結果與分析

2.1 3個葡萄品種感染霜霉病菌的田間調查

由表1可以看出,3個供試葡萄品種在田間自然狀態下均感霜霉病,病情指數范圍為 19.50～36.71。但對霜霉病的抗性表現出明顯的差異,‘西拉’發病率最低為45.28%,病情指數最小為19.50,對霜霉病抗性最強;‘赤霞珠’抗性最弱,發病率最高,病情指數最大。

表1 田間3個葡萄品種霜霉病自然發病情況1)

2.2 霜霉病菌孢子囊接種濃度的選擇

用不同濃度的霜霉病菌孢子囊菌液侵染葡萄離體葉圓片,8×104孢子囊/mL和16×104孢子囊/mL接種霜霉病菌所引起的病情指數最高,達到了極顯著水平,能在短時間內區分不同品種對霜霉病的抗性差異(表2)。但16×104孢子囊/mL濃度接種霜霉菌部分葡萄葉片第3天病情指數達到5級,侵染過快不利于信號物質的分析和測定。據此認為8×104孢子囊/mL最佳,并在以下的試驗中以此濃度作為合適的處理濃度。

表2 葡萄離體葉圓片對霜霉菌孢子囊接種濃度的敏感性1)

2.3 3個葡萄品種離體葉片接種抗性表現

室內離體葉片接種試驗發現3個品種均感霜霉病(表3),但品種間對霜霉病的抗性表現出了顯著的差異,病情指數范圍為24.36～61.29。其中,‘西拉’對霜霉病抗性最好,病情指數最低;‘赤霞珠’最感病,病情指數最高。表明3個葡萄品種室內離體葉片接種霜霉菌的抗性表現與霜霉病的自然發病情況基本一致,本方法較為可靠。

表3 3個葡萄品種離體葉片對霜霉病菌的抗性表現1)

2.4 不同感病期葡萄葉片內源NO和H2O2含量變化

由圖1得知,3個葡萄品種葉片接種前(0級)內源NO水平基本一致,病級為1級時,3個品種葉片NO含量增加,且都達到了極顯著水平;其中‘西拉’變化最大,增加48.80%。接種前‘西拉’葉片內源H2O2含量最高,接種后葉片內源H2O2含量變化幅度最大,病級為1級時 H2O2含量增加37.73%,達到了極顯著水平;‘赤霞珠’和‘霞多麗’含量增加較大,達到了顯著水平。

圖1 3個葡萄品種不同病級葉片內源NO和H2O2含量變化

2.5 不同感病期葡萄葉片內源JA和ABA含量變化

接種霜霉病菌前‘赤霞珠’JA和ABA含量較高,‘西拉’含量較低;接種后,3個葡萄品種葉片內源JA和ABA含量都有所增加,且存在品種間差異(圖2)。‘赤霞珠’病級達到2級時,JA含量達到最大值,變化最明顯,增加157.08%,達到了極顯著水平;‘霞多麗’和‘西拉’在3級時葉片內源JA含量都達到最大值,‘霞多麗’變化(117.01%)大于‘西拉’(71.50%)。3個品種葉片內源ABA含量均在3級時達到最大值,‘赤霞珠’變化較明顯,增加 95.27%,達到了極顯著水平;‘霞多麗’和‘西拉’變化較小,差異不顯著。

圖2 3個葡萄品種不同病級葉片JA和ABA含量變化

2.6 不同感病期葡萄葉片乙烯釋放量的變化

由圖5可以看出,‘西拉’健康葉片乙烯水平最高,‘赤霞珠’最低;在感病初期不同抗性葡萄葉片乙烯釋放量幾乎沒有變化,5級時都達到了最大值(圖3),但品種間差異不顯著。

3 討論

圖3 3個葡萄品種不同病級葉片ETH釋放量變化

目前我國主栽釀酒葡萄品種多為歐亞種葡萄(Vitis vini f era),對霜霉病抗性較弱。特別是在高濕度的沿海地區,霜霉病嚴重地影響著葡萄的生長和果實的產量及品質,造成嚴重的經濟損失。本試驗對膠東葡萄主栽地區蓬萊的‘西拉’、‘霞多麗’和‘赤霞珠’3個主要釀酒葡萄品種進行了田間自然發病率調查,結果表明‘西拉’抗病性最強,‘赤霞珠’抗病性最弱,室內離體葉片接種試驗表明,接種以8×104孢子囊/mL最佳,可在短時間內區分不同品種之間對霜霉菌的抗性差異,且感病情況與田間調查趨勢基本一致,這與沙月霞等[4]的研究結果相似。

NO和H2O2含量變化是植物對許多生物或者非生物脅迫的一種普遍的早期反應,在植物的正常生長發育和對環境應答等過程中起著十分重要的作用。最近,Manjunatha等以珍珠粟(pearl millet)為材料,證明NO通過參與和調控過敏反應、胼胝質形成和病程相關蛋白表達等早期防衛反應來增強對霜霉病菌的抗性[16]。Ma? olepsza和 Rózalska研究發現番茄葉片感染灰葡萄孢(Botrytis cinerea)后,NO和ROS含量迅速升高,NO和H2O2達到有效的平衡才能增強番茄對灰霉病的抗性[17]。本研究發現葡萄葉片接種霜霉病菌后NO和H2O2含量都有所升高,病級為1級時,3個葡萄品種葉片內源NO和H2O2含量都達到峰值,且這種變化在抗性品種西拉中更為強烈,說明NO和H2O2在葡萄抗霜霉菌的抗性反應中起重要作用,可能均是葡萄應答霜霉病菌侵染過程的信號物質。但在葡萄霜霉病達到5級時,H2O2含量再次增加。推測霜霉病造成葉片干枯或死亡時,大量積累的H2O2對葡萄造成氧化脅迫。

ABA[18]、JAs[19]和乙烯[13]均可作為一種脅迫信號物質,誘導防衛反應以抵御病原菌和環境脅迫。研究發現,黃瓜經褐斑菌誘導后葉片中JA大量積累,最高可達5 000ng/g鮮重[20]。葡萄不同節位葉片中ABA含量不同,26～30節位處最高,達到420 ng/g鮮重[21]。本研究亦發現葡萄葉片內源JA含量高于ABA,接種霜霉病菌后‘赤霞珠’葉片中JA和ABA水平明顯升高,JA變化較早且更為顯著。推測,JA和ABA可能是參與‘赤霞珠’與霜霉病菌互作過程中的重要信號物質。葡萄葉片感病過程中乙烯幾乎沒有變化,病級達到5級時才發生變化,且品種間沒有顯著差異。推測乙烯不是參與葡萄對霜霉病應答的信號分子,乙烯量升高是葉片的衰老和枯死所致。

在植物響應外界各種刺激的過程中,多種信號物質之間的互作和應答(cross-talk),構成復雜的網絡系統,共同激活下游的一系列抗性相關反應。徐茂軍等的研究表明,JA是作用于NO下游的信號物質[22]。NO和H2O2協同或單獨作用誘導棉花細胞對大麗輪枝菌毒素的抗性反應[23]。近期研究發現,蝴蝶蘭(Phalaenopsis aphroditaRchb.F.)衰老過程中葉片和萼片NO和H2O2含量迅速增加,利用NO供體和NO清除劑證明NO位于H2O2上游[24]。那么在葡萄和霜霉病互作過程中NO、H2O2、ABA和JA等信號物質在信號轉導鏈中的相互關系怎樣?這些信號分子在調控霜霉菌抗性反應中的具體作用機制如何尚有待進一步深入研究。

[1]李亞娟,俞立民.葡萄品種對霜霉病的抗性及葉片溢泌物對游動孢子囊萌發的影響[J].農業科學研究,2008,29(1):25-27.

[2]Slaug hter A R,Hamiduzzaman M M,Gindro K,et al.Betaaminobutyric acid-induced resistance in grapevine against downy mildew:involvement of pterostilbene[J].Eur J Plant Pathol,2008,122(1):185-195.

[3]Trouvelot S,Varnier A L,Allègre M,et al.A beta-1,3 glucan sulfate induces resistance in grapevine againstPlasmopara viticolathrough priming of defense responses,including HR-like cell death[J].Mol Plant Microbe Interact,2008,21(2):232-243.

[4]沙月霞,王國珍,樊仲慶.不同釀酒葡萄品種對霜霉病的抗性分類[J].西北農業學報,2006,15(5):114-117.

[5]Kim Y C,Kim S Y,Choi D,et al.Molecular characterization of a pepper C2 domain-containing SRC2 protein implicated in resistance against host and non-host pathogens and abiotic stresses[J].Planta,2008,227(5):1169-1179.

[6]Mur L A,Carver T L,Prats E.NO way to live;the various roles of nitric oxide in plant-pathogen interactions[J].J Exp Bot,2006,57(3):489-505.

[7]Torres M A,Jones J D,Dangl J L.Reactive oxygen species signaling in response to pathogens[J].Plant Phy siol,2006,141(2):373-378.

[8]Wawrzynska A,Christiansen K M,Lan Y,et al.Powdery mildew resistance conferred by loss of the enhanced disease resistance1 protein kinase is suppressed by a missense mutation in keep on going,a regulator of abscisic acid signaling[J].Plant Physiol,2008,148(3):1510-1522.

[9]Fan B,Shen L,Liu K L,et al.Interaction between nitric oxide and hydrogen peroxide in postharvest tomato resistance response toRhizopus nigricans[J].J Sci Food Agri,2008,88:1238-1244.

[10]Sultana F,Hossain M M,Kubota M,et al.Induction of systemic resistance inArabidopsis thalianain response to a culture filtrate from a plant growth-promoting fungus,Phomasp.GS8-3[J].Plant Biol,2009,11(1):97-104.

[11]石慧,勵映聰,羅云波,等.外源茉莉酸甲酯處理對采后綠熟番茄果實根霉果腐病抗病性的影響[J].食品科技,2008(5):255-258.

[12]Flors V,Ton J,Jakab G,et al.Abscisic acid and callose:team players in defense against pathogens[J].J Phytopathol,2005,153:7-8.

[13]Belhadj A,Telef N,Cluzet S,et al.Ethephon elicits protection againstEry siphe necatorin grapevine[J].J Agric Food Chem,2008,56(14):5781-5787.

[14]郝再彬,蒼晶,徐仲.植物生理實驗技術[M].哈爾濱:哈爾濱工業大學出版社,2002:198-199.

[15]陳康,李杰,唐靜,等.一氧化氮參與調節鹽脅迫下玉米幼苗脫落酸的積累[J].植物生理與分子生物學學報,2006,32(5):577-582.

[16]M anjunatha G,Niranjan-Raj S,Prashanth G N,et al.Nitric oxide is involved in chitosan-induced systemic resistance in pearl millet against downy mildew disease[J].Pest Manag Sci,2009,65(7):737-743.

[17]Ma? olepsza U,Rózalska S.Nitric oxide and hydrogen peroxide in tomato resistance.Nitric oxide modulates hydrogen peroxide level in ο-hydroxyethylorutin-induced resistance toBotrytis cinereain tomato[J].Plant Physiol Biochem,2005,43(6):623-635.

[18]周金鑫,胡新文,張海文,等.ABA在生物脅迫應答中的調控作用[J].農業生物技術學報,2008,16(1):169-174.

[19]Balbi V,Devoto A.Jasmonate signalling network inArabidopsis thaliana:crucial regulatory nodes and new physiological scenarios[J].New Phytol,2008,177:301-318.

[20]石延霞,于洋,傅俊范,等.病原菌誘導后黃瓜葉片中脂氧合酶活性與茉莉酸積累的關系[J].植物保護學報,2008,35(6):486-490.

[21]吳雅琴,常瑞豐,李春敏,等.葡萄實生樹開花節位與內源激素變化的關系[J].園藝學報,2006,33(6):1313-1316.

[22]徐茂軍,董菊芳,朱睦元.NO通過水楊酸(SA)或者茉莉酸(JA)信號途徑介導真菌誘導子對粉葛懸浮細胞中葛根素生物合成的促進作用[J].中國科學,2006,36(1):66-75.

[23]賈芝琪,袁海永,李穎章.大麗輪枝菌毒素對棉花懸浮細胞NO和H2O2的產生和GST基因表達的影響[J].科學通報,2007,52(8):911-917.

[24]Tewari R K,Kumar P,Kim S,et al.Nitric oxide retards xanthine oxidase-mediated superoxide anion generationinPhalaenopsisflower:an implication of NO in the senescence and oxidative stress regulation[J].Plant Cell Rep,2009,28(2):267-279.

Variation of signal substances in grape cultivars in response to Plasmopara viticola

Lin Zhiqiang, Li Xidong, Hou Lixia, Zhang Yinghao, Liu Xin
(College of Life Science,Qingdao Agricultural University,Qingdao266109,China)

Several disease-resistant signal substances,such as abscisic acid(ABA),hydrogen peroxide(H2O2),nitric oxide(NO),jasmonic acid(JA)and ethylene(ETH),in the leaves of 3 grape cultivars,‘Syrah’,‘Chardonnay’and ‘Cabernet Sauvignon’,with different resistance toPlasmopara viticola,were studied in order to detect the signal transduction mechanisms.The results showed that H2O2and NO were involved in the disease response,and‘Syrah’showed strong resistance;JA and ABA were involved in the disease response of the susceptible variety‘Cabernet Sauvignon’.Moreover,the level of ETH had no significant difference among the 3 cultivars used.It was presumed that H2O2,NO,JA and ABA were involved in resistance against the downy mildew disease,but there were significantly different reactions among the three cultivars employed.

grape; downy mildew; signal substances; resistance

S 436.631.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2010.02.010

2009-04-08

2009-05-26

農業部“948”項目(2006-G26)

*通信作者Tel:0532-88030224;E-mail:liuxin6080@yahoo.com.cn