早期帕金森病大鼠線粒體損傷的研究

于德欽, 殷盛明, 彭 巖, 王冬梅, 王彥霞, 董方圓, 孫藝平,, 張萬(wàn)琴

帕金森病(Parkinson's Disease,PD)是一種與年齡相關(guān)的中老年慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。PD早期發(fā)病時(shí)間長(zhǎng),有文獻(xiàn)報(bào)道可長(zhǎng)達(dá) 10年之久[1]。其早期發(fā)病時(shí)間包括各種致病因素作用于機(jī)體并引起中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)變性所需時(shí)間和中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性至 PD臨床癥狀出現(xiàn)所需時(shí)間。臨床尸檢資料發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性死亡達(dá) 50%,紋狀體內(nèi)多巴胺水平降低至 70%～80%,患者才開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀[2]。

目前有關(guān) PD發(fā)病機(jī)制的研究,多集中在 PD臨床期,PD早期發(fā)病機(jī)制尚不清楚,且相關(guān)的研究很少。這主要是由于臨床上很難收集到未出現(xiàn)臨床癥狀的又處于 PD無(wú)病期和臨床前期的病例,因此只能借助于采用早期 PD動(dòng)物模型。將 6-OHDA注入腦內(nèi)黑質(zhì)紋體系統(tǒng)損毀大鼠多巴胺能神經(jīng)元所制成的模型可以模擬早、中、晚各個(gè)時(shí)期 PD患者的病理改變[3,4]。有研究表明 6-OHDA注射入大鼠紋狀體將引起為期數(shù)周的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)緩慢的逆行性退行性變,使用小劑量單側(cè)紋狀體內(nèi)注射法可建立 PD臨床前期動(dòng)物模型[5,6]。本研究采用 6-OHDA制備早期 PD大鼠模型,觀察 PD發(fā)病早期大鼠中腦內(nèi)神經(jīng)元線粒體的超微結(jié)構(gòu)改變及其抗氧化能力的改變。這將為 PD早期發(fā)病機(jī)制及 PD的早期防治提供線索。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 制備早期 PD動(dòng)物模型,選用健康雄性 SD大鼠,體重 180～220克,用 4%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于腦立體定位儀上,門齒桿 3.4mm。根據(jù) George Paxinos＆Charles Watson大鼠腦定位圖譜選取靶點(diǎn),PD臨床前組注射靶點(diǎn)為紋狀體,坐標(biāo)定位為 AP=+1.0,R=3.0mm(向右旁開(kāi)),H=-4.5mm(硬膜下)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)注射溶解于 Vehicle(0.1%抗壞血酸,0.9%NaCl)的 6-OHDA,20μg/3μl。 注射時(shí) 間約3min,留針 3min后慢慢退出。對(duì)照組動(dòng)物在相同條件下,靶點(diǎn)內(nèi)分別給以同等容積的 Vehicle。

1.2 電鏡技術(shù) 取上述各組 SD大鼠的 60μm厚冠狀腦片,用含有 2%多聚甲醛和 1.25%戊二醛的 0.1mol/L的鹽酸緩沖液固定。2%鋨酸后固定1h,常規(guī) Epon812平板定位包埋。光鏡下選取特定組織,將其貼在預(yù)制的空白包埋塊上,超薄切片,鈾鉛雙染,透射電鏡觀察并攝片。每只動(dòng)物隨機(jī)選取2個(gè)包埋塊制備超薄切片,每個(gè)包埋塊撈取 2張銅網(wǎng),選用反差良好的一個(gè)銅網(wǎng)在電鏡下觀察,在放大100,000倍條件下,每張銅網(wǎng)選取 1個(gè)網(wǎng)眼,隨機(jī)在其上下左右 4個(gè)角度各攝片 1張,放大 20,000以進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。觀察并比較中腦右側(cè)神經(jīng)元內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1.3 線粒體的分離 動(dòng)物分別被斷頭取腦置于冰袋上,迅速取出腹側(cè)中腦黑質(zhì)區(qū)腦組織塊,浸在緩沖液 A[250mmol/L甘露糖醇,0.5mmol/L EDTA,5mmol/L Hepes,0.1%(W/V)BSA pH7.4]中,剪碎。600×g,離心 5min,2次,去除細(xì)胞核及碎片。上清液在 10300×g,離心 10min。沉淀部分為線粒體粗制品。將沉淀部分懸浮于 5ml緩沖液 A中。分裝 4個(gè)含有 20ml 30%(v/v)Percoll[用 225mol/L甘露糖醇,1mmol/L EDTA,25mmol/L Hepes,0.1%(w/v)BSA(pH7.4)]配制離心管中,95000×g,離心 30min。收集底層褐黃色部分(線粒體)。

1.4 MAO-B活性測(cè)定 神經(jīng)元內(nèi)的 MAO-B主要位于線粒體(線粒體外膜),是線粒體的標(biāo)志酶之一。制備線粒體,加入 40倍體積 50mol/L磷酸鈉緩沖液后于冰浴中漿化,用 Lowry法測(cè)定其蛋白量,進(jìn)一步采用分光光度計(jì)法測(cè)定 MAO-B活性(按南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明)。

1.5 SOD活性測(cè)定 用生理鹽水制備中腦勻漿,12500×g離心,取上清液,按南京建成生物公司試劑盒說(shuō)明用黃嘌呤氧化酶法測(cè) SOD活性,用 DTNB顯色法測(cè) GSH-Px活性。

1.6 MDA含量測(cè)定 取腦勻漿上清液0.15 ml,用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(MDA)含量。

2 結(jié) 果

2.1 線粒體電鏡結(jié)果 早期 PD動(dòng)物中腦神經(jīng)元內(nèi),大多數(shù)線粒體發(fā)生形態(tài)學(xué)改變,可見(jiàn)線粒體局部水腫,部分線粒體嵴排列紊亂、部分嵴消失及發(fā)生髓樣變性,另一部分線粒體膜融合破損(見(jiàn)圖1)(見(jiàn)圖中箭頭所示)。

圖1 給藥側(cè)黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變

圖2 中腦 MAO-B活性與同側(cè)對(duì)照組相比**P＜0.01

圖3 中腦 MDA活性與同側(cè)對(duì)照組相比**P＜0.01

圖4 中腦 SOD活性與同側(cè)對(duì)照組相比**P＜0.01

2.2 線粒體抗氧化活性

2.2.1 MAO-B與對(duì)照組相比,PD早期動(dòng)物中腦神經(jīng)元線粒體 MAO-B的酶活性明顯增高(見(jiàn)圖2)。

2.2.2 MDA與對(duì)照組相比,PD早期動(dòng)物中腦神經(jīng)元線粒體 MDA活性明顯增高(見(jiàn)圖3)。

2.2.3 SOD與對(duì)照組相比,PD早期動(dòng)物中腦神經(jīng)元線粒體 SOD活性明顯降低(見(jiàn)圖4)。

3 討 論

在 PD的發(fā)病過(guò)程中,有以下幾個(gè)階段:(1)無(wú)病期,此期僅有危險(xiǎn)的致病因素存在。(2)臨床前期,此期 PD的病理過(guò)程開(kāi)始,但無(wú)臨床癥狀,有臨床尸檢資料發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性脫失達(dá) 50%,紋狀體內(nèi)多巴胺水平降低至70%～80%,患者才開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀[2]。因此 PD的早期發(fā)病可達(dá)幾十年之久[1]。(3)臨床期,此期PD的特征性的臨床癥狀己出現(xiàn),從治療的角度出發(fā),這已為時(shí)過(guò)晚。關(guān)于 PD治療,目前多采用 LDopa,但其不能阻止黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性,且使用后具有遠(yuǎn)期不良效應(yīng)。因此,對(duì) PD早期發(fā)病機(jī)制的研究具有重要的社會(huì)意義。

PD的病因和發(fā)病機(jī)制至今不完全清楚,很可能是多種因素長(zhǎng)期作用的結(jié)果,包括基因突變、接觸環(huán)境毒物(如魚(yú)藤酮、MPTP、6-OHDA等)、腦內(nèi)炎癥反應(yīng)和免疫功能失調(diào)等[7]。線粒體功能障礙參與 PD的發(fā)病已有很多研究,PD患者普遍存在著線粒體復(fù)合物 I活性下降和活性氧生成增加,這導(dǎo)致氧化應(yīng)激和增加神經(jīng)元對(duì)興奮性毒性死亡的易感性[8]。氧化應(yīng)激與線粒體功能障礙還互為因果,惡性循環(huán)。SOD、MDA和 MAO-B均為線粒體內(nèi)的常見(jiàn)酶。SOD為抗氧化酶,SOD可將 O2-·轉(zhuǎn)化為 H2O2,有效清除自由基。自由基的產(chǎn)生與清除失衡產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用,使線粒體 DNA發(fā)生氧化損傷。MDA為過(guò)氧化脂質(zhì)的降解產(chǎn)物,生成過(guò)多的 MDA可誘導(dǎo) Ca2+從線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放,導(dǎo)致胞內(nèi) Ca2+升高,誘發(fā)細(xì)胞凋亡。MAO-B可降解單胺類神經(jīng)遞質(zhì),腦中的MAO-B活性隨年齡增加而升高,能使神經(jīng)遞質(zhì)高度氧化,導(dǎo)致腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的異常改變[9]。但是,線粒體氧化損傷是否參與早期 PD的發(fā)病機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用小劑量單側(cè)紋狀體內(nèi)注射法建立PD臨床前期動(dòng)物模型,經(jīng)旋轉(zhuǎn)行為及邁步實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與對(duì)照組無(wú)明顯改變,證實(shí)為可靠的 PD臨床前動(dòng)物模型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在 6-OHDA損毀側(cè),PD臨床前期動(dòng)物與對(duì)照組相比,PD早期腦內(nèi)神經(jīng)元的線粒體已出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的病理?yè)p傷,中腦的 SOD活性明顯降低,MDA及 MAO-B的酶活性明顯增高。提示線粒體的抗氧化能力降低可能參與早期 PD大鼠中腦神經(jīng)元的損傷機(jī)制。這將為 PD的防治及抗PD藥物的研制開(kāi)發(fā)提供重要的理論依據(jù)和線索。

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