PSI誘導 PC12細胞的 PD模型中分子伴侶家族的氧化修飾

張 穎, 楊藝敏, 白 晶, 常 明, 胡林森

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病。目前,PD的病因和發(fā)病機制尚不完全清楚。新近泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitinproteasome system,UPS)功能障礙及其引起的蛋白水解應激機制備受關(guān)注。

UPS是細胞內(nèi)重要的非溶酶體蛋白降解途徑,在許多與增殖和凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)的降解中起重要作用[1]。遺傳及散發(fā) PD研究均提示 UPS功能受損可能是不同病因作用的共同途徑[2]。文獻表明[3],蛋白酶體抑制劑(PSI)處理的細胞模型能較全面地模擬 PD的病理特征,并且與現(xiàn)有的其它模型比較具有諸多優(yōu)點。故本實驗選用 PSI處理的 PC12細胞作為 PD實驗模型,在此基礎上探討 PD的發(fā)病機制。目前多數(shù)學者認為氧化應激在 PD黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡過程中起重要作用。近年來亦有文獻表明 UPS功能的損害也可導致自由基的生成及氧化應激[4],這提示有必要在 PSI處理的 PD細胞模型中研究氧化應激的機制。

近年來國外研究者們開始采用蛋白質(zhì)組學的方法研究氧化修飾蛋白質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)變性病中的作用,但多集中在阿爾茨海默病,在 PD中的研究較少。迄今為止采用蛋白質(zhì)組學方法在 PD中已鑒定出 3種氧化修飾的蛋白質(zhì):UCH-L1、NF-200和GFAP[5]。本實驗首先通過 2,4-二硝基苯肼(DNP)的衍生步驟標記含有羰基的氧化蛋白質(zhì),而后采用2D凝膠電泳、質(zhì)譜鑒定與 Western印跡技術(shù)相結(jié)合的方法在 PD模型中鑒定氧化修飾的蛋白質(zhì),期望為進一步研究 PD的發(fā)病機制提供新的證據(jù),為 PD治療藥物的研發(fā)提供新的候選靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自 GiBco公司。吖啶橙購自 Sigma公司。溴化乙啶為 Amresco產(chǎn)品。DNP購自東京化成工業(yè)株式會社。抗 DNP一抗購自 Molecular Probe公司。二抗、顯色液等購自 Sigma公司。硝纖膜、IPG膠條等均購自 Amersham公司。電泳系統(tǒng)、掃描儀、分析軟件和質(zhì)譜儀均為 Amersham公司產(chǎn)品。ST-Ⅱ型半干轉(zhuǎn)移槽購自大連醫(yī)科大學分生實驗室。

1.2 細胞模型的建立 PC12細胞復蘇后,以2×105/ml的密度接種于底面積 25cm2的塑料培養(yǎng)瓶,于 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3d更換一次培養(yǎng)液。選取對數(shù)生長期細胞,以 1∶3～1∶4比例傳代。24h后更換培養(yǎng)液,實驗組加入終濃度 10μmol/L的 PSI(以 DMSO溶解);對照組加入 DMSO,實驗組與對照組 DMSO終濃度均為0.1%,繼續(xù)孵育 24h后收集兩組細胞用于進一步實驗。MTT法檢測細胞存活率;AO和 EB染色觀察細胞凋亡的存在;HE染色觀察細胞內(nèi)包含體的形成。

1.3 蛋白樣品的制備、一向等電聚焦電泳及IPG膠條的 DNP衍生 提取細胞總蛋白。240μg樣品與緩沖液混合后加入膠條槽,13cm、pH3～10的IPG膠條在電泳儀上進行水化及等電聚焦電泳。然后將 IPG膠條在含 20mmol/L DNP的 2mol/L的鹽酸溶液中室溫孵育 20min,而后在含 30%甘油的2mol/L Tris-Base溶液中洗 15min。

1.4 二向凝膠電泳 將平衡后的 IPG膠條轉(zhuǎn)移至 12.5%SDS-PAGE凝膠(16cm×15cm×1.0 mm)上端,在垂直電泳儀上進行二向電泳。待溴酚藍距底邊約 4cm時停止電泳。

1.5 分析膠進行二維 Western blot染色 將用作分析膠的二向膠電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。以 1∶200的兔抗鼠 DNP抗體作為一抗,4℃過夜孵育。以 1∶10000的羊抗兔堿性磷酸酶偶聯(lián)抗體作為二抗,室溫孵育 1h。以 BCIP/NBT溶液作為顯色液,至藍紫色蛋白點清晰呈現(xiàn)后,以雙蒸水終止反應。

1.6 制備膠進行熱考馬斯亮藍染色 制備膠于 20%TCA中固定 2h以上。蒸餾水漂洗凝膠20min,加入熱考染液,50℃搖床振蕩 30min。加入脫色液,50℃搖床振蕩脫色,每次 1h,以背景藍色脫凈為止。

1.7 圖像分析、統(tǒng)計學處理及質(zhì)譜鑒定 掃描Western blot及考染的制備膠圖像,應用 2D Evolution軟件進行分析,以單個蛋白抗-DNP免疫染色強度/制備膠蛋白考染強度來標準化蛋白的氧化水平,對來自 4次重復實驗的結(jié)果以均數(shù) ±標準差±s)表示,采用 t檢驗。在制備膠上找到與 Western blot結(jié)果相匹配的、有統(tǒng)計學意義的蛋白點,切膠、酶切、點靶及質(zhì)譜鑒定。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測結(jié)果 10μmol/L PSI作用 24h可顯著降低 PC12細胞的存活率,存活率降至85.46%±1.75%(對照組設為 100%),與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 吖啶橙和溴化乙啶染色結(jié)果 在顯微鏡下觀察可見,對照組(見圖 1A)PC12細胞大小、形態(tài)均勻一致,胞膜完整,核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu),偶見早期凋亡細胞,凋亡百分率為 2.13% ±0.86%。實驗組(見圖 1B)PC12細胞大小、形態(tài)不等,胞體變大,胞漿疏松,胞膜發(fā)泡,可見早期凋亡細胞,凋亡細胞的核染色質(zhì)著明亮綠色呈斑塊狀或圓珠狀,凋亡百分率為 12.41%±3.61%,與對照組比較差異顯著(P＜0.05)。

2.3 HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示,對照組(見圖 2A)PC12細胞胞漿嗜酸性染色,胞核嗜堿性染色。實驗組(見圖 2B)PC12細胞胞體及胞核增大,胞漿內(nèi)空泡增多,并出現(xiàn)嗜酸性包含體(實心箭頭所示),胞核嗜堿性染色(空心箭頭所示)。

2.4 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果 制備膠上的蛋白點與Western blot圖像匹配較好(見圖3)。應用 2D Evolution軟件進行分析,兩組比較氧化水平有統(tǒng)計學差異的蛋白點共有 40個,而后對這 40個蛋白點進行質(zhì)譜鑒定。經(jīng)質(zhì)譜鑒定,有 13個蛋白點被鑒定出來,其中 3個為分子伴侶家族成員:蛋白點 58被鑒定為含 TCP1的伴侶素亞單位 3(chaperonin contai-ning TCP1,subunit 3,也稱為 CCT);蛋白點 73被鑒定為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 58(glucose regulated protein 58,GRP58);蛋白點 46被鑒定為熱休克蛋白 70(HSC70,亦稱為 HSP70)。從考染的制備膠(見圖3A和圖 3C)可見這 3個蛋白點大致分布在分子量50～70kDa,等電點 5～6之間,蛋白點豐度較高。這3個蛋白點的氧化水平,可見 P值均 ＜0.05(見表1)。NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫提供的蛋白質(zhì)的詳細信息(見表2)。可見其序列覆蓋率均在 10%以上,期望值(錯誤鑒定的幾率)均為 0.000,提示結(jié)果可信度較高。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 58的肽指紋圖譜(見圖4)。

表1 對照組與實驗組單個蛋白氧化水平比較±s)

表1 對照組與實驗組單個蛋白氧化水平比較±s)

*氧化水平:單個蛋白抗-DNP免疫染色強度/蛋白考染強度(n=4)

46 58731.9621±0.31951.3432±0.09102.3496±0.13762.9349±0.50221.8341±0.28113.0054±0.3206-2.8308-2.8777-3.2558＜0.05＜0.05＜0.02

表2 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果

圖1 吖啶橙和溴化乙啶染色 ×200標尺:10μm

圖2 HE染色 ×200標尺:10μm

圖3 對照組和實驗組考染顯示的總蛋白及 Western blot顯示的氧化蛋白點比對

圖4 蛋白點 73(GRP58)的肽指紋圖譜

3 討 論

本實驗顯示,10μmol/L PSI作用 PC12細胞 24h可很好地模擬 PD的兩大基本病理特征,即神經(jīng)元喪失(凋亡)和神經(jīng)元內(nèi)嗜酸性包含體的形成。這為進一步研究 PD發(fā)病機制建立了可靠的模型。

本實驗前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[6],基礎狀態(tài)下的PC12細胞有 5大類、共 19個蛋白點發(fā)生氧化修飾,其中即包括分子伴侶家族成員。此次實驗質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示,與對照組比較,實驗組差異表達的氧化蛋白點中有 3個均被鑒定為分子伴侶家族成員:CCT、GRP58和 HSP70。在細胞內(nèi),約 10% ～20%新合成的多肽鏈需要分子伴侶的幫助才能正確折疊。迄今為止已發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)變性病與錯誤折疊蛋白質(zhì)的聚集及沉積有關(guān),如 PD與 AD等。這提示,分子伴侶可能在神經(jīng)變性病中發(fā)揮重要作用。

CCT是迄今為止真核細胞胞漿中發(fā)現(xiàn)的唯一一個伴侶素。CCT的主要功能是以 ATP依賴的過程促進新合成的 α-、β-微管蛋白及肌動蛋白的正確折疊[7]。有人認為 CCT參與大約 9%～15%的哺乳動物蛋白的折疊,如細胞周期相關(guān)蛋白質(zhì) cyclin E等[8]。本研究首次發(fā)現(xiàn) CCT的氧化修飾,也是首次在 PSI處理的 PD細胞模型中發(fā)現(xiàn) CCT的氧化修飾,推測這可能由蛋白酶體功能抑制導致的氧化應激所致。推測 CCT的氧化可能影響其行使正常生物學功能,影響細胞骨架及細胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)的正確折疊,這可能有助于解釋實驗組細胞形態(tài)學的改變及凋亡的出現(xiàn)。

GRP58是分子量約 60kDa的應激蛋白。定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔的 GRP58對于蛋白質(zhì)二硫鍵的形成是必要的,而二硫鍵對蛋白質(zhì)的正確折疊則是必須的。Dennis等[9]的實驗表明,過氧化氫可誘導包括GRP58在內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的氧化修飾。本實驗在PSI處理 PC12細胞的 PD細胞模型中發(fā)現(xiàn)GRP58被顯著地氧化修飾(P＜0.05)。推測 GRP58的氧化修飾可能與 PSI抑制蛋白酶體功能導致的氧化應激有關(guān)。另外,本實驗室李興安等[10]在同一模型細胞包含體內(nèi)首次檢測到了 GRP58的存在。結(jié)合本實驗發(fā)現(xiàn) GRP58的氧化修飾,推測發(fā)生氧化修飾的GRP58可能引起其功能紊亂,導致自身及其它錯誤折疊的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)聚集,進而對細胞產(chǎn)生毒性作用,這可能有助于解釋細胞內(nèi)包含體的形成及細胞凋亡的出現(xiàn)。

HSP70在正常情況下以較低水平表達,在炎癥等應激情況下合成增加,從而減輕不利條件的損害。Castegna等[11]在 AD腦組織中檢測到 HSP70的氧化修飾,但在 PD中尚未見 HSP70發(fā)生氧化修飾的報道。本實驗首次在 PSI處理的 PC12細胞 PD模型中發(fā)現(xiàn) HSP70被顯著地氧化修飾(P＜0.05)。推測實驗組 HSP70自身水平的升高是細胞對蛋白酶體功能抑制的一種防御反應,而升高的起保護作用的HSP70的氧化修飾則可能阻礙其分子伴侶功能的發(fā)揮,從而喪失對應激反應的防護作用。

總之,本實驗通過蛋白酶體功能的抑制成功地再現(xiàn)了 PD典型的病理特征;采用氧化修飾亞蛋白質(zhì)組學方法篩查發(fā)現(xiàn)分子伴侶家族的氧化修飾。這提示我們在后續(xù)的研究中從這些蛋白質(zhì)入手,進一步深入研究蛋白質(zhì)的定位、定量、功能等變化,及其與PD包含體形成和細胞凋亡的關(guān)系,以期為 PD發(fā)病機制的探討及治療藥物的研發(fā)提供新線索。

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