腦梗死人群 NOS1基因多態(tài)性與脂代謝的相關(guān)性

高 鵬, 吳 江, 杜丹華, 李蘊博, 趙節(jié)緒, 胡林森

腦梗死是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病,多發(fā)病,遺傳學(xué)研究表明腦梗死是一種多基因遺傳病,遺傳因素是其發(fā)病的一個重要因素[1];而高膽固醇血癥、吸煙、糖尿病和高血壓等是腦梗死的常見危險因素。

研究表明 ApoE基因敲除鼠表現(xiàn)出明顯的高膽固醇血癥和進(jìn)行性的內(nèi)皮功能障礙[2],高膽固醇血癥可降低 NOS1基因的表達(dá)[3]。Xie[4]等報道在敲除 ApoE基因誘導(dǎo)的高膽固醇血癥小鼠,血管內(nèi)皮NOS1基因表達(dá)下調(diào),進(jìn)而血管內(nèi)皮損傷。而 NOS1基因的表達(dá)上調(diào)可顯著改善高膽固醇血癥引發(fā)的動脈粥樣硬化癥(AS)[5]。

由此可見,NOS1基因與血管內(nèi)皮功能和高膽固醇血癥的發(fā)生可能有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)NOS1基因多態(tài)性與腦梗死的發(fā)生有關(guān)[6],在此,本研究探討了腦梗死患者 NOS1基因多態(tài)性與脂代謝的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究共納入 605例無血緣關(guān)系的腦梗死患者。樣本來自吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 2005年 ～2006年的住院患者,男 430例,女175例,平均年齡 60.1±11.7歲。由 2名神經(jīng)科醫(yī)生根據(jù)詳細(xì)的神經(jīng)科檢查、頭部 CT或頭部 MRI,并依據(jù) TOAST分型標(biāo)準(zhǔn)[7]對腦梗死患者做出診斷,除外房顫、腫瘤等栓子來源的腦栓塞性疾病,除外肝腎功能不全,血液系統(tǒng)疾病。所有入組人群均簽署知情同意書,并采集全血用于 DNA提取。

1.2 方法 我們選擇了 rs9658281(SNP1,MspⅠsite)和 rs2682820(SNP2,HaeⅢ site)2個單核苷酸多態(tài)性位點,采用限制性酶切片段多態(tài)性的方法對 SNPs基因型進(jìn)行分析。應(yīng)用 DNA提取試劑盒(Promega,北京)提取基因組 DNA。應(yīng)用 Primer 5.0軟件設(shè)引物,SNP1上游引物:5'-CAACCCTTAGCTTAAATCAG-3',下游引物 5'-GTGCCAGACCTAAGATGC-3';SNP2上游引物 5'-CCGAGGGT-AACTGGACATTG-3',下游引物 5'-CAAGGTAGGTGCTATAATCTC-3',由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為 25μl,其中雙蒸水 18μl,10mmol Tris-HCl(pH 8.3),50mol KCl,1.5mmol MgCl2,4種dNTP各 200μmol,引物各 0.4μl,Taq DNA聚合酶(Promega,北京)1.0U,基因組 DNA 30 ～ 50ng。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5min,94℃變性 45s,55℃復(fù)性 1min,72℃延伸 1min,35個循環(huán),最后72℃延伸 10min。酶切體系:PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶(Promega,北京)于 37℃水浴 4～6h酶切,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(90mV)40min,在凝膠成像系統(tǒng)(UVP,美國)下觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用擬和優(yōu)度檢驗分析腦梗死患者基因型頻率的分布是否符合 Hardy-Weinberg平衡;UNPHASED遺傳學(xué)軟件[8]Qtphase對近似正態(tài)分布的計量資料總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)進(jìn)行數(shù)量性狀分析,應(yīng)用 UNPHASED遺傳學(xué)軟件 cocaphase進(jìn)行分析,P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SNP1和 SNP2位點雜合度分析及 Hardy-Weinberg平衡分析 SNP1經(jīng) PCR擴(kuò)增及 MspⅠ酶切后,產(chǎn)生 GG、AG、AA等 3種基因型,基因型分布GG∶AG∶AA為 497∶100∶8,等位基因分布 A∶G為 116∶1094。 SNP2為 A/C二態(tài) SNP,經(jīng) PCR擴(kuò)增及 HaeIII酶切后產(chǎn)生 C/C、A/C及 A/A 3種基因型,基因型分布 CC∶AC∶AA為 230∶273∶102;等位基因分布 C∶A為 733∶477。擬和優(yōu)度檢驗表明入組患者的基因型未偏離 H-W平衡(SNP1χ2=1.309,P=0.252;SNP2 χ2=1.846,P=0.174),說明我們選擇的樣本是隨機(jī)婚配的群體。

2.2 NOS1基因 SNP1和 SNP2位點的連鎖不平衡分析 應(yīng)用 UNPHASED軟件對 SNP1和 SNP2位點進(jìn)行連鎖不平衡分析顯示,SNP1和 SNP2不在同一個連鎖不平衡區(qū)。

2.3 SNP1和 SNP2位點多態(tài)性與 TC、TG、HDL-C、LDL-C、BMI的關(guān)系 NOS1基因 rs9658281的等位基因頻率與 TC明顯相關(guān),攜帶 G等位基因個體的總膽固醇水平(TC)明顯高于攜帶 A等位基因的個體(χ2=4.583,P=0.032),而與 TG、HDL-C、LDL-C水平無明顯相關(guān) (見表1);NOS1基因rs2682820的等位基因頻率與 TC與 TG、HDL-C、LDL-C水平無明顯相關(guān)(見表2)。

表1 SNP1位點多態(tài)性與血脂的數(shù)量性狀分析

表2 SNP2位點多態(tài)性與血脂的數(shù)量性狀分析

3 討 論

本研究應(yīng)用數(shù)量性狀分析方法探討了腦梗死患者 NOS1基因多態(tài)性與血脂水平的相關(guān)性。腦梗死是多基因遺傳病,它的形成是由于多個微效基因變異的共同作用引起的,這些變異在群體中的分布是連續(xù)的,在不同個體間只有量的差異,而無質(zhì)的不同,常稱這類性狀為數(shù)量性狀。因此對多基因遺傳疾病的某些連續(xù)性性狀進(jìn)行數(shù)量性狀分析更符合疾病發(fā)生的本質(zhì)。

NOS1基因定位于染色體的 12q24.2-q 24.31[9],全長 ＞240kb,包含 29個外顯子,編碼nNOS。最近的研究發(fā)現(xiàn),在進(jìn)化上古老的常見多態(tài)中即使是最輕微的有害變異也不會在人群進(jìn)化中保存下來[10],許多與疾病相關(guān)的遺傳標(biāo)記位于非編碼區(qū)或基因功能未知的區(qū)域[11～16]。因此我們選擇NOS1基因內(nèi)含子上的 rs9658281和 rs2682820位點為遺傳標(biāo)記。內(nèi)含子是基因組中的一種重要調(diào)控元件,內(nèi)含子可通過自身的剪接影響基因的表達(dá),也可直接對基因的表達(dá)起調(diào)控作用[17],通過對內(nèi)含子基因多態(tài)性的研究可能對疾病的發(fā)生提供線索。NOS1基因 5'-非編碼區(qū)存在選擇性剪切位點,不同的 mRNA剪切變體導(dǎo)致 NOS1基因在抑制動脈粥樣硬化(AS)新內(nèi)膜形成及血管保護(hù)中作用的差異。我們在腦梗死患者的血漿總膽固醇水平與 SNP1位點的數(shù)量性狀分析中發(fā)現(xiàn),攜帶 G等位基因個體的總膽固醇水平明顯高于攜帶 A等位基因的個體(χ2=4.583,P=0.032),證明 G等位基因與血漿增高的總膽固醇水平相關(guān)。因此我們推測攜帶 G等位基因人群的 mRNA剪切變體對高膽固醇血癥所致血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用較弱,從而更易引起 AS的發(fā)生,導(dǎo)致腦梗死。

此外,我們的研究人群來自于北方漢族人,這一研究結(jié)果還需要在不同地域、不同種族的人群中進(jìn)行大樣本的重復(fù)來驗證。

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