米諾環(huán)素對大鼠腦缺血再灌注損傷的腦保護作用

熊建忠, 陸兵勛

缺血性腦卒中的致死及致殘率非常高,對于缺血性腦卒中目前缺乏有效的治療方法。抗血小板治療被認為是一種有效預防卒中的方法,對于急性缺血性腦卒中,靜脈溶栓是目前唯一被證明有效的方法,但只能使部分患者獲利[1]。最近的研究顯示,腦梗死后的炎癥反應對腦卒中的預后有很大的影響。米諾環(huán)素(Minocycline,MC)是半合成第二代四環(huán)素類抗生素,目前發(fā)現(xiàn)它除了具有抗菌作用之外,還具有很強的抗炎作用[2]。本研究將通過給腦缺血再灌大鼠腹腔注射米諾環(huán)素,了解米諾環(huán)素對缺血再灌注后環(huán)氧化酶 2(cyclooxygenase-2,COX-2)、前列腺素 E2(prostaglandin E2,PGE2)、細胞凋亡,腦缺血體積的影響。為米諾環(huán)素治療缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組 選擇健康成年雄性 SD大鼠48只 (中南大學動物實驗室提供),體重 (250～300g),隨機分為 4組,每組 12只,即假手術組(術后30min,腹腔注射米諾環(huán)素 45mg/kg;生理鹽水組(大鼠缺血后 30min,腹腔注射等量生理鹽水);治療組(大鼠缺血后 30min,腹腔注射米諾環(huán)素 45mg/kg);預處理組 (大鼠缺血前 12h腹腔注射米諾環(huán)素45mg/kg)。

1.2 模型的制備 采用改良的 ZeaLonga線栓法建立右側大腦中動脈閉塞再通 (MCAO)模型,于缺血 1.5h后撥出線栓,形成腦缺血再灌注。假手術組(線栓插入深度為 10cm,不造成腦缺血)其余處理相同。

1.3 MRI檢查 使用 GE 1.5T超導型磁共振成像系統(tǒng),3英寸表面線圈,行冠狀位 T2WI系列掃描。T2WI掃描參數(shù)(TR/TE/NEX4200/94/6)層厚 3mm,層間隔 0mm,FOV8cm×8cm,矩陣 256×256。利用體積分析軟件測出病變體積(LV)及缺血側半球體積(HVi),對側半球體積(HVc)。校正后缺血病變體積比 =(HVc-HV i+LV)/HVc×100[3]。

1.4 COX-2免疫組織化學染色 大鼠缺血再灌注24h后,用 10%水合氯醛麻醉,等滲生理鹽水和4%多聚甲醛 PBS液進行心臟灌注,斷頭取腦,取距嗅球尖端后 7～11mm間的腦組織塊,置于 4%多聚甲醛中固定,脫水,包埋,連續(xù)切片,片厚 6μm。免疫組織化學染色嚴格按照說明書操作進行。染色成功后用高倍顯微鏡進行拍照,每張切片選取 5個視野,采用 Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析光密度值。

1.5 前列腺素 E2水平測定 大鼠麻醉后用等滲生理鹽水快速灌洗,斷頭取患側腦組織,分離額頂部皮質,置微型勻漿器中加 0.1ml無水乙醇研磨,再加等滲生理鹽水 0.9ml充分研磨成勻漿,4℃離心3500r/min,15min,取勻漿上清液 200μl,按放免試劑盒說明操作,測出樣品溶度。

1.6 Hoechst染色 切片常規(guī)脫臘透明后,置于 6孔板上以 0.9%生理鹽水洗 3遍,每次 3min,吸盡液體,然后加入 0.5ml的 Hoechst染色液,手搖晃動以充分染色,染色 5min,完成后將切片置于載玻片上,滴上 1滴抗淬滅液,蓋上潔凈的蓋玻片,在熒光顯微鏡下觀察神經細胞凋亡形態(tài)。用熒光顯微鏡進行拍照,結果用 Image-Pro Plus 6.0計算各區(qū)域神經細胞凋亡的百分率。

1.7 統(tǒng)計學分析 全部數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行分析,數(shù)據(jù)以±s)表示 ,數(shù)據(jù)之間采用單因素方差分析檢測,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

本實驗結果顯示,假手術組腦組織僅有少量凋亡細胞及少量 COX-2陽性細胞,PGE2在假手術組表達很低。生理鹽水組細胞凋亡率,PGE2水平明顯升高,COX-2強烈表達,與假手術組相比差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),生理鹽水組 T2WI檢測可見缺血側大片高信號強度區(qū)。米諾環(huán)素預處理組和治療組與生理鹽水組相比,細胞凋亡率、PGE2水平明顯下降,腦缺血體積縮小,COX-2光密度降低差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),結果(見表1、表2;見圖1～圖8)。

表1 各組大鼠腦缺血體積及細胞凋亡率(%)

表2 各組大鼠 COX-2光密度值及 PGE2水平

3 討 論

缺血性腦血管病的致死、致殘率非常高。目前是僅次于心臟病和癌癥之后的第 3位致死原因。最近研究顯示,腦梗死后的炎性反應對腦卒中的預后有很大的影響[4]。腦梗死后炎性因子包括環(huán)氧化酶2、前列腺素 E2、白細胞介素-1、腫瘤壞死因子等。COX-2、PGE2參與了腦缺血后腦損傷的發(fā)生、發(fā)展,并與腦缺血的預后關系密切。Kinoshita等研究顯示,腦缺血 90min后或大腦中動脈永久閉塞,COX-2在半暗帶和鄰近皮質區(qū)表達強烈[5]。環(huán)氧化酶是催化花生四烯酸生成前列腺和血栓素的限速酶。COX-2為誘導型,在大多數(shù)組織中檢測不到[6]。米諾環(huán)素是一種半合成的第 2代四環(huán)素衍生物 ,對革蘭氏陽性及革蘭氏陰性球菌等都有較好的抗菌作用[7]。最近研究表明米諾環(huán)素具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等神經保護作用[8]。本組數(shù)據(jù)顯示生理鹽水組COX-2、PGE2的表達較假手術組明顯增多,米諾環(huán)素組治療組和預處理組能明顯降低 COX-2、PGE2的表達。本試驗結果與 Kim等結果相似[9]。目前認為米諾環(huán)素降低缺血后 COX-2,PGE2的表達,是通過抑制誘導型一氧化氮合酶 (iNOS)、減少一氧化氮的產生、抑制還原型輔酶Ⅱ氧化酶的活性、抑制P38促分裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的磷酸化等途徑,抑制小神經膠質細胞的激活與增殖而起作用的[10]。

腦缺血后神經元的死亡包括壞死和凋亡過程。在腦缺血急性期,神經元壞死和凋亡并存,細胞壞死位于缺血中心區(qū),細胞凋亡主要出現(xiàn)在缺血半暗帶區(qū)[11]。凋亡可能決定了最終梗死體積。本組數(shù)據(jù)顯示,米諾環(huán)素預處理組和米諾環(huán)素治療組、大鼠腦缺血的體積、凋亡細胞率較生理鹽水組減少。米諾環(huán)素抗細胞凋亡作用與其對半胱氨酸蛋白酶Caspase-1和 Caspase-3的抑制[12],阻止細胞色素 C和促凋亡蛋白(Smac/DIABLO)的釋放,上調抗凋亡因子 bcl-2等作用有關[13]。本實驗結果進一步證實了米諾環(huán)素的抗凋亡作用。

本實驗研究表明腦缺血再灌注后 COX-2、PGE2增加,細胞凋亡率增加,而米諾環(huán)素能明顯減少 COX-2、PGE2的表達,及缺血半暗帶的細胞凋亡率,對腦缺血再灌注損傷有腦保護作用。米諾環(huán)素是第 2代四環(huán)素類抗生素,多項研究表明其在腦缺血[14]、肌萎縮性 (脊髓 )側索硬化[15]及帕金森病等疾病的發(fā)生過程中具有神經保護作用。然而,現(xiàn)今對于米諾環(huán)素的神經細胞保護作用的研究還處于動物實驗階段,其在臨床上的神經保護作用有待進一步研究。

圖1 假手術組

圖2 生理鹽水

圖3 預處理組

圖4 30min組

圖5 假手術組

圖6 生理鹽水組

圖7 預處理組

圖8 30min

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