神經生長因子對 Aβ致 AD細胞模型中神經元內酸堿度改變及細胞凋亡的影響

李 華, 方伯言, 高 峰

阿爾茨海默病 (Alzheimer's disease,AD)是老年人最常見的神經系統退行性疾病,神經元缺失為其3大病理特征之一,其病因及其發病機制尚不完全清楚。研究[1]證實自發的中樞神經細胞死亡與不可逆轉的細胞損傷有關。細胞凋亡被認為與 AD神經元退行性變過程中幾個階段有關,所以有些研究者[2,3]認為 AD中神經細胞死亡是由凋亡介導的。細胞內酸化是細胞凋亡過程中的一種細胞內信號變化,通過影響核酸內切酶的活性、影響原癌基因在凋亡過程中的作用、影響細胞凋亡發生率等途徑促進細胞凋亡。本實驗利用體外培養大鼠大腦皮質神經元細胞,應用 Aβ25-35誘導大鼠皮層神經元凋亡,檢測細胞內 pH值變化及膜上 Na+/H+交換蛋白 1(NHE1)、神經元凋亡的特異標志蛋白鈣調蛋白(CaM)表達,闡明細胞內酸化與神經元凋亡的關系。并在制模前后分別加用神經生長因子(nerve growth factor,NGF)干預,明確 NGF可能通過激活 NHE1來抑制神經元凋亡,起到神經保護的作用,從而為NHE1激活劑應用于 AD的治療提供新的理論依據。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑 Aβ25-35、胎牛血清、馬血清、DMEM、F12培養基、兔抗 CaM單克隆抗體、兔抗NHE1單克隆抗體,以上藥品試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;酸堿度熒光探針 2',7'-二(羧乙基)-5(6)羧基熒光黃酯(BCECF/AM)購自Calbiochem公司。

1.2 方法

1.2.1 神經元細胞培養 取出生 24h內的 SD大鼠乳鼠(遼寧醫學院動物實驗中心提供),75%酒精浸泡消毒,無菌條件下取出大腦皮層,置于培養基中,剔除血管和軟腦膜,剪成 1mm3左右的小塊。加入 0.125%胰蛋白酶 37℃消化 10min。待細胞分散后,加入含 10%胎牛血清和 10%馬血清的 DMEM/F12培養基終止消化。200目篩網過濾,1000轉離心 10min,用含 10%胎牛血清和 10%馬血清的DMEM/F12制成細胞懸液,調整細胞密度為 1×105～1×106/ml,接種在鋪有 L-多聚賴氨酸的 6孔培養板中,置于 37℃、5%CO2培養箱中培養。培養 48h后加入含阿糖胞苷(終濃度為 5mg/L)的培養基,抑制非神經元細胞增殖。以后每 3d換液一次,培養7d后加用 Aβ25-35處理,并按不同的實驗分組加用NGF處理。

1.2.2 構建 AD細胞模型 AD組:利用Aβ25-35誘導大腦皮層神經元細胞建立 AD細胞模型,Aβ25-35終濃度為 20μmol/L,接觸 24h。 NGF預防組:加用 Aβ25-35前 72h加用 NGF培養,NGF終濃度為50μg/L。 NGF治療組:加入 Aβ25-35片段接觸 24h后加用 NGF繼續培養,NGF終濃度 50μg/L。以上各組在 Aβ25-35脫離接觸后 12、24、48、72h收集細胞用于實驗。

1.2.3 Aβ25-35的孵育 選擇 Aβ25-35片段,用三蒸水配制成 100μmol/L,過濾,分裝,-20℃凍存,使用前老化處理并配制成所需濃度(將 Aβ25-35溶解在DMSO中,再用 DMEM稀釋,置于 37℃下孵育 7～14d,即為老化處理)。

1.2.4 Western印跡分析法測 NHE1及 CaM表達 將收集的細胞用冷的 PBS沖洗,放入預冷的裂解緩沖液中裂解,用 Lowry法測定蛋白質含量,電泳后將 PAGE凝膠中的蛋白質電轉移至PVDF(硝酸纖維素膜)上,取出后將膜放入 3%BSA阻斷緩沖液中,封閉 60min,TBS洗膜 3次,將膜放入一抗中(1∶500稀釋),4℃過夜。TTBS沖洗后,將膜放入二抗(1∶500稀釋)中,室溫孵育 1～2h,用 TTBS洗膜 3次,最后用 TBS洗膜一次,放入 NBT/BCIP顯色液中避光顯色,直至染色出現,終止反應。將蛋白印跡顯影圖掃描,利用凝膠自動分析成像軟件 Chem Image 5500對蛋白帶進行灰度值分析。以上試驗步驟重復 3次。

1.2.5 細胞內 pH值的測定

1.2.5.1 制定標準曲線 用 DMEM培養液清洗細胞 2次,加入終濃度 1μg/ml熒光染料 BCECF/AM,37℃孵育 30min,清洗 3次后重新懸浮于 pH值分別為 6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6的 KCl溶液(25mmol/L HEPES,145mmol/L KCl,0.8mmol/L MgCl2,1.8mmol/L CaCl2,5.5mmol/L葡萄糖),加入1μg/ml尼爾尼亞素,37℃孵育 10min,立即用激光共聚焦顯微鏡檢測,以氬激光 488nm激發細胞內BCECF,檢測相應細胞 530nm和 640nm發射熒光,求出熒光比值,做出 pH值與熒光比值之間關系的標準曲線,pH與 530nm/640nm熒光比值之間有良好的線性關系(r＞0.995)。

1.2.5.2 細胞內 pH值測定 收集 5×106/ml細胞,用 DMEM培養基清洗 3次,加入 1μg/ml熒光染料 BCECF/AM,37℃孵育 30min,清洗 3次后上機檢測,記錄 530nm與 640nm發射熒光,求出兩者的比值。通過標準曲線推算細胞內 pH值。

1.2.6 統計學處理 實驗數據用(均值 ±標準差)表示,實驗重復 5次,用 SPSS 11.5軟件包進行分析,兩組間比較采用 LSD,s post hoc test進行統計學分析,以 P＜0.05表示差異有顯著性;P＜0.01表示差異非常顯著。

2 結 果

2.1 各時間點 Western-blot結果比較

2.1.1 與 Aβ25-35組比較 NGF預防組內 NHE1具有高表達性,與 Aβ25-35組有顯著差異(P＜0.01);與 Aβ25-35組比較,NGF治療組內 NHE1具有高表達性,與對照組有顯著差異(P＜0.01),而且隨培養時間的延長各組內 NHE1表達均有不同程度的增強(見圖1、表1)。

2.1.2 與 AD組比較 NGF預防組內 CaM具有低表達性,與 AD組有顯著差異(P＜0.01);與AD組比較,NGF治療組內除加用神經生長因子 12h時與對照組比較 CaM表達差異無顯著性外,其余各時間點及處理因素下與對照組比較均有低表達性,與AD組有顯著差異(P＜0.01)(見圖2、表2)。

2.2 各時間點神經元細胞內 pH值比較 各組神經細胞內 p H隨培養時間延長均呈降低趨勢,各時間點比較 NGF預防組及治療組細胞內 pH降低幅度較 AD組細胞低,兩組比較有明顯差異(P＜0.01,P＜0.05)(見表3)。

表1 各時間點 NHE1(130k Da)的表達±s)

表1 各時間點 NHE1(130k Da)的表達±s)

與 AD組比較*P＜0.01,△P＜0.05

AD組NGF預防組NGF治療組3.38±0.215.63±0.45*4.03±0.35△4.40±0.336.71±0.79*5.44±0.37*5.62±0.777.80±0.56*6.67±0.65*6.64±0.577.92±0.78*7.77±0.23*

表2 各時間點 CaM(49k Da)的表達 ±s)

表2 各時間點 CaM(49k Da)的表達 ±s)

與 AD組比較*P＜0.01

AD組NGF預防組NGF治療組1.33±0.220.99±0.23*1.24±0.281.77±0.111.33±0.22*1.48±0.32*1.89±0.231.61±0.34*1.68±0.17*2.1±0.191.80±0.11*1.90±0.24*

表3 各時間點神經元細胞內pH值比較 ±s)

表3 各時間點神經元細胞內pH值比較 ±s)

與 AD組比較*P＜0.01,△P＜0.05

AD組NGF預防組NGF治療組6.92±0.127.07±0.11*6.97±0.28△6.75±0.227.03±0.22*6.92±0.32*6.71±0.176.94±0.34*6.91±0.17*6.74±0.256.88±0.11*6.81±0.23*

圖1 NHE1的 Western-blot檢測

圖2 CaM的 Western-blot檢測

3 討 論

阿爾茨海默病(AD)是一種進行性發展的致死性神經退行性疾病,嚴重影響患者的工作能力和生活質量,也為家庭和社會帶來沉重的負擔。關于 AD的發病進展存在許多假說,如老年變性病、遺傳、病毒感染、炎癥、鋁中毒[4]、膽堿系統功能缺陷、細胞骨架改變及顱腦外傷等假說,但均不完善,針對以上病因采取的抗炎、抑制膽堿酯酶、調控退化谷氨酸能神經元的突觸活性及擴血管改善供血、營養神經和抗氧化治療等治療措施,也僅是對癥治療,不能延緩病程的進展。因此,尋找針對病因的治療藥物和手段,是當今研究的難點和熱點。深入研究 AD的發病機制和治療措施成為醫務工作者刻不容緩的責任。

AD的主要病理特征為老年斑、神經原纖維纏結、區域選擇性神經元數目減少和顆粒空泡變性,神經元細胞減少與神經系統的不可逆轉的神經元凋亡有關[1]。由于各種物理和化學刺激因素誘導的細胞凋亡都同時出現細胞內酸化,細胞酸化與細胞凋亡之間的關系就成為人們關注的熱點[5,6]。Ibarreta D[7]等利用 AD患者的淋巴母細胞研究證明,α-IgM誘導的細胞內酸化在 AD更為明顯,這就說明 AD患者的淋巴母細胞對酸負荷后細胞內 H+緩沖能力和質子外流率都降低。本實驗中無論 AD組還是 NGF治療組、NGF預防組隨造模時間的延長,細胞內 pH值持續降低,AD組 pH值降低趨勢尤其明顯,以上研究結果說明,細胞內的 p H降低在 AD的病理生理進程中起著重要作用。

鈉氫離子交換蛋白(Na+/H+Exchanger,NHE)是維持細胞內環境的細胞膜蛋白,它是存在于所有真核細胞的一種跨膜蛋白,該蛋白涉及細胞的多種功能,包括調節細胞內 pH值(intracellur pH,pHi)、細胞體積的控制以及離子轉運等。Urcelay E等[8]研究證明,AD患者淋巴母細胞細胞膜上 NHE的激活可以促進淋巴母細胞的增殖,這種效應與表面受體介導的鈣調蛋白信號途徑有關,它可以被 NHE的抑制劑所抑制。NHE激活或表達增多,可導致細胞內的 p H升高,而 NHE的抑制或表達下調,則使細胞內的 pH降低,細胞酸化。本實驗中各組細胞隨模上NHE1表達的增強,細胞內 p H值下降趨勢減慢,但并沒完全停止,更沒有出現隨 NHE1表達增強細胞內 pH上升的情況,這說明在實驗時間段內 NHE1表達增強不能完全對抗 Aβ25-35誘導神經元凋亡的毒性作用。越來越多的資料表明鈣調蛋白與許多神經系統疾病有關,AD的發生已被證實部分是由于腦細胞內 CaM以及依賴于 CaM的激酶(PKC,PLA)等活性增高所致[9]。NHE1的 C端功能域存在與鈣調蛋白結合的兩個位點,鈣調蛋白能與 NHE1特異性結合,是其必要的活性調節亞單位,CaM的啟動與激活可抑制 NHE表達。實驗結果顯示隨造模時間的延長各組內細胞 CaM與 NHE1的表達均是持續性增強的,這可能 Aβ25-35的細胞毒性持續作用有關。

神經生長因子(NGF)是最早發現和最典型的神經營養因子,其生物學效應可以分為神經系統和非神經系統兩大類,有促進神經元分化、保護效應神經元、誘導神經纖維定向生長和再生等多種效應。本實驗各組數據顯示,NGF預防組與 NGF治療組內NHE1均具有高表達性,與 AD組比較有顯著差異(P＜0.01,P＜0.05),而且隨培養時間的延長各組內NHE1表達均有不同程度的增強。這說明作為NHE1激動劑,神經生長因子作用明顯。與 NHE1表達相對應,在 NGF作用下,預防組及治療組內 pH值較 AD組明顯增高,差異具有顯著性(P＜0.01)。相反,NGF預防組與治療組內各時間點細胞 CaM表達較 AD組明顯要低,差異有顯著性(P＜0.01)。以上研究結果說明神經生長因子能顯著增強 NHE1表達,有效地對抗 Aβ25-35對離體培養的神經元細胞的毒性作用。

總之,神經生長因子可通過增強細胞膜上 NHE1的表達,有效地提高細胞內 pH值,對抗 Aβ25-35對離體培養的神經元細胞的毒性作用,達到抗神經元細胞凋亡的目的。神經生長因子分子量大,不易通過血腦屏障,這是神經生長因子應用于 AD治療的最大的困擾。相信隨著受體介導轉運的經鼻腔腦靶向給藥、促進內源性 NGF合成的化合物、增強內源性NGF作用的化合物、NGF基因治療、NGF聯合治療等幾方面研究[10]的不斷進展,神經生長因子及其它類型的 NGF激動劑如咪唑等在 AD治療中得到應用。

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