β阻滯劑對(duì)急性期實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

王 巖, 閆麗儒, 紀(jì) 輝, 張純慧, 李 丹, 董艷波

腦出血是一種高發(fā)病率和高死亡率的腦血管疾病,約 1/3患者伴有神經(jīng)損傷,并直接影響患者預(yù)后,因而目前腦出血的治療重點(diǎn)在于減輕出血周圍腦組織損傷。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載被認(rèn)為是引起細(xì)胞死亡及腦組織損傷的中心環(huán)節(jié)[1]。內(nèi)皮素(Endothelin,ET)和降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)是器官局部血流調(diào)節(jié)因子,ET具有強(qiáng)烈縮血管作用,也能對(duì)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞造成直接損害;而 CGRP是已知最強(qiáng)的擴(kuò)血管物質(zhì)之一[2,3],并有引起細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度下降的作用。正常情況下兩者保持相對(duì)穩(wěn)定,維持動(dòng)態(tài)平衡,病理情況時(shí)兩者平衡失控。有報(bào)道[4]表明腦出血患者的CGRP及 ET的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律與腦出血腦水腫病程變化及預(yù)后有關(guān)。因此,若能在腦出血早期抑制Ca2+內(nèi)流并維持ET和 CGRP動(dòng)態(tài)平衡,則受損的神經(jīng)細(xì)胞可望得到恢復(fù),這可能是今后治療腦出血的一條可行途徑。本實(shí)驗(yàn)擬在研究美托洛(β-阻滯劑)對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度以及CGRP和 ET水平的影響,進(jìn)而驗(yàn)證其對(duì)腦出血的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選擇健康雄性成年 Wistar大鼠 84只,體重 200～230g,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。β-阻滯劑選用酒石酸美托洛爾片;CGRP、ET放免試劑盒由天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司提供;肝素鈉、30%水合氯醛、微量進(jìn)樣器、腦立體定位儀、低溫離心機(jī)、微量注射器、手術(shù)器械由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 Wistar大鼠 84只隨機(jī)分為正常對(duì)照組(12只)、模型組(36只,24h、48h、72h各12只 )、藥物治療組(36只,24h、48h、72h各 12只)。

1.2.2 腦出血模型制備 模型組及藥物治療組大鼠稱重后按 0.4mg/100g劑量給予水合氯醛腹腔麻醉,俯臥位固定于立體定位儀,鼠尾用 40℃水浴 10min,頭皮下中切口約 1cm,于顱骨背側(cè)前囟后0.2mm中線向左旁 2.9mm處鉆孔,大鼠尾尖約 5cm斷尾取血 40μl,固定于立體定位儀上并沿鉆孔垂直進(jìn)針,深約 6mm,緩緩注入鼠血,留針 1min后退針,縫合頭皮。病理證實(shí)造模是否成功:按各組預(yù)定時(shí)間取尾狀核部腦組織 2塊,制備光、電鏡標(biāo)本。

1.2.3 給藥方法 模型組造模后即刻給予0.9%生理鹽水 1.5ml灌胃,藥物治療組造模后即刻給予美托洛爾100g/kg(溶于0.9%生理鹽水1.5ml)灌胃。

1.2.4 血漿 ET及 CGRP測(cè)定 各組大鼠在相應(yīng)觀察點(diǎn)(造模后 24h、48h、72h)乙醚麻醉,摘除眼球取血約 3ml,置入含 10%EDTA二鈉 30μl和抑肽酶 40μl的離心管內(nèi),低溫 (4℃)高速離心,3000r/min,共 10min,取上清 -70℃凍存待測(cè)。CGRP及ET放免試劑盒購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司,操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.5 用 Fura-2/AM熒光探針法測(cè)定血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度。

1.2.5.1 腦細(xì)胞分離 參考曹云鵬方法進(jìn)行了改進(jìn)。各組大鼠在相應(yīng)觀察點(diǎn)(造模后 24h、48h、72h)斷頭后剝離全腦,以冰冷的 D-Hanks液沖洗,去除小腦、腦干及部分白質(zhì)并仔細(xì)剝離腦膜、血管(其中腦出血大鼠清除血腫),再次以 D-Hanks液沖洗 3次后剪碎,置于 20ml含 0.25%胰蛋白酶的 D-hanks液中,在 37℃條件下消化 15min后,以冰冷的含10%小牛血清的適量 Hanks液終止反應(yīng)。組織塊以吸管輕輕吹打后過 200目篩網(wǎng),濾液以 1000rpm離心 5min,沉淀再次以 Hanks液沖洗 1次,最后將細(xì)胞懸浮于 37℃的 Hanks液中。臺(tái)盼藍(lán)除外試驗(yàn)檢查,細(xì)胞存活率在 90%以上,將細(xì)胞數(shù)調(diào)整到 2×106個(gè)/ml。

1.2.5.2 Fura-2/AM負(fù)載 將上述細(xì)胞懸液1.5ml于 37℃下預(yù)溫 5min后,加入用 DMSO配制的0.5mmol/L的 Fura-2/AM溶液(終濃度為 5μmol/L),37℃恒溫振蕩 45min,負(fù)載后的細(xì)胞以含 0.2%牛血清白蛋白的 Hanks液沖洗 2次,以 1000rpm離心 5min,最后沉淀用Hanks液懸浮,測(cè)前將細(xì)胞懸液37℃復(fù)溫 5min。

1.2.5.3 熒光測(cè)定 采用日立 F-4500型雙波長(zhǎng)熒光分光光度計(jì),發(fā)射光波長(zhǎng)為 510nm,選定激發(fā)光波長(zhǎng)為 340nm和 380nm,兩狹縫均為 5nm。先測(cè)定靜息下兩波長(zhǎng)的熒光值(F340、F380),兩波長(zhǎng)的最大熒光值由加入濃度為 10%的 TritonX-10020μl測(cè)得(Fmax340、Fmax380);最小熒光值由加入濃度為 100mmol/L的乙二醇雙四乙酸(EGTA)80μl(pH＞8.5)獲得 (Fmin340、Fmin380)。根據(jù)公式:[Ca2+]i=Kd(R-Rmin)Fmin380/(Rmax-R)Fmax380nmol/L,計(jì)算其中 Kd為 224nmol/L,R=F340/F380。

2 結(jié) 果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度 正常組大鼠相應(yīng)部位神經(jīng)細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度為 216.2±29.8nmol/L。與正常對(duì)照組比較,模型組 24h后血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度即顯著增高(P＜0.01),且 72h內(nèi)逐漸增加。與模型組比較,藥物治療組 24～72h各時(shí)間點(diǎn)血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度均明顯降低(P＜0.05),但均高于正常組(P＜0.01)(見表1)。

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血漿 ET、CGRP含量 正常組大鼠血漿 ET含量 98.46±45.47ng/L、CGRP含量為 44.33±6.90ng/L,ET/CGRP比值為 2.22。模型組血漿 CGRP含量高于正常組(P＜0.05),且 72h內(nèi)逐漸增高;ET含量高于正常組(P＜0.05),以 48h升高最明顯,之后有下降趨勢(shì)。藥物治療組血漿 ET及 CGRP含量均高于正常組 (P＜0.05),且 72h內(nèi)維持在一定水平;藥物治療組 24h ET與 CGRP含量高于模型組,CGRP含量增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而 ET含量增高無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);藥物治療組 48h、72h ET及 CGRP含量低于模型組(P＜0.05)(見表2)。

2.3 各組不同時(shí)間點(diǎn) ET/CGRP比值 模型48h組比正常組 ET/CGRP比值增高明顯 (P＜0.05),以 ET升高為主;藥物治療 24h組、48h組比正常組、模型組 ET/CGRP比值降低明顯 (P＜0.05),均以 CGRP升高為主;其余各組與正常組ET/CGRP比值差別不明顯(見表3)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化(nmol/L)

表2 各組不同時(shí)間血清CGRP及ET水平變化(ng/L)

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)ET/CGRP比值

3 討 論

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使,是神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能不可缺少的因素,主要參與細(xì)胞內(nèi)外信息的傳遞、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、酶的代謝與調(diào)節(jié)等。正常細(xì)胞中,細(xì)胞內(nèi)外 Ca2+濃度差大致在1萬倍,這種濃度差是保證細(xì)胞發(fā)揮生理功能的前提。細(xì)胞內(nèi)鈣離子不僅在正常的細(xì)胞功能中起重要作用,而且參與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。

既往研究已明確,Ca2+超載及其所觸發(fā)的一系列有害代謝是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的最后通路[1],細(xì)胞內(nèi) Ca2+超載在神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[5]。Ca2+超載不僅引起神經(jīng)細(xì)胞蛋白質(zhì)和磷脂代謝紊亂,導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞毒性腦水腫,而且也是引起腦血管痙攣、血腦屏障通透性增加、從而使血管源性腦水腫加劇的重要因素。

因此,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度對(duì)于了解正常細(xì)胞功能及與 Ca2+有關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制均有重要意義。ET是一種由 21個(gè)氨基酸組成的血管活性多肽,是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種強(qiáng)有力的血管收縮因子,通過激活鈣通道、增加鈣離子內(nèi)流、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞收縮[2],進(jìn)而引起血管收縮。

CGRP是體內(nèi)最強(qiáng)的舒血管生物活性多肽,為內(nèi)源性血管舒張物質(zhì)。ET與 CGRP二者廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)中[3]。正常情況下,CGRP與 ET之間處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)維持腦血管的舒縮功能,CGRP對(duì) ET的生物效應(yīng)能產(chǎn)生拮抗作用、能抑制病理?xiàng)l件下 ET的大量釋放[6]。CGRP還可以抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生,擴(kuò)張血管,提高腦血流量,有利于側(cè)支循環(huán)的開放,減輕缺血缺氧和腦組織損傷的作用,并有引起細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度下降的作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道[4],腦出血急性期血漿 CGRP及 ET水平高于對(duì)照組,以 ET升高尤為顯著。

研究認(rèn)為血漿 ET含量增高原因可能與腦組織缺血、缺氧、應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞損傷及局部凝血酶增加等諸多因素有關(guān),這些因素導(dǎo)致 ET的基因表達(dá)增強(qiáng),從而增加 ET釋放。而腦出血時(shí) CGRP水平增高可能是一種代償機(jī)制,CGRP既參與腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程,也在機(jī)體病理?xiàng)l件下有防御和代償作用,與ET在一定范圍內(nèi)保持平衡[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血急性期血腫周圍鈣離子濃度明顯高于正常組,且 3d內(nèi)逐漸增高;血漿中 ET含量亦高于正常組,以第 2天升高最明顯,第 3天血漿 ET含量有所下降,但仍高于正常;血漿中 CGRP含量高于正常組,其變化規(guī)律與血漿ET含量變化規(guī)律基本一致,但以 ET升高尤為顯著。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[8,9]相符,且與臨床上腦出血病情多在 2～3d內(nèi)惡化相一致,支持腦出血時(shí)鈣離子濃度、CGRP與 ET的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律與腦出血、腦水腫病程變化及預(yù)后有關(guān)。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載被認(rèn)為是引起細(xì)胞死亡及腦組織損傷的中心環(huán)節(jié),ET可能是腦出血發(fā)生、發(fā)展及惡化的重要因素[10],而 CGRP在腦出血急性期可代償性增高,拮抗 ET作用,抑制鈣離子內(nèi)流,發(fā)揮其內(nèi)源性保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)表明:在 β-阻滯劑作用下,鈣離子濃度明顯下降,從而減輕因細(xì)胞內(nèi)鈣超載引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡及腦組織損傷;而 ET及 CGRP均有升高,但低于模型組,以 ET降低尤為明顯,ET水平高于正常,但穩(wěn)定在一定水平不持續(xù)上升,并且與 CGRP水平相適應(yīng),ET/CGRP比值更加接近(略低于)正常,并在一定范圍內(nèi)保持平衡,在這種平衡之中 CGRP略占上風(fēng),從而減輕了 ET為主的腦組織損害,為CGRP腦保護(hù)作用的發(fā)揮創(chuàng)造條件。

本實(shí)驗(yàn)僅研究了美托洛爾(β-阻滯劑)對(duì)大鼠腦出血后神經(jīng)損傷的保護(hù)作用,并對(duì)其作用機(jī)制作了簡(jiǎn)單探討,認(rèn)為其神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制鈣超載、調(diào)控血漿 ET和 CGRP含量有關(guān)。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載及 ET與 CGRP的動(dòng)態(tài)平衡破壞均參與了腦出血后繼發(fā)性腦組織的損傷,且各因素間相互聯(lián)系,互為因果,具體機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

β-阻滯劑在臨床上主要用于高血壓病的治療,而臨床上腦出血早期不主張使血壓降得過低,以免造成腦灌注壓不足,加重腦乏氧,進(jìn)而加重腦損傷。然而 β-阻滯劑降壓作用緩慢且較溫和,一般連服 1w方達(dá)最高療效。而且 β-阻滯劑作用結(jié)果是使心律減慢、心輸出量減少、總外周阻力有所降低,血壓不變或略降,但是腦組織血流量并不下降,而是其他組織血流下降。所以 β-阻滯劑并非腦出血治療的絕對(duì)禁忌。

本研究可能為腦出血的輔助治療提供新的有效途徑。

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