增殖誘導配體在肺癌中的表達及臨床意義*

孫寶蘭,朱 俐,王惠民△

(江蘇省南通大學:1.附屬醫院醫學檢驗中心 226001;2.航海醫學研究所 226001)

幾十年來,人們在肺癌的防治方面進行了大量的研究,但肺癌的發病率和病死率仍逐年上升。統計資料表明:近20年來我國男性肺癌病死率增加120.93%,女性增加90.41%;在沿海經濟發達地區男性發病率已達首位,女性亦已居第2、3位。增殖誘導配體(a proliferation-inducing ligand,APRIL)屬于腫瘤壞死因子超家族,在多種腫瘤組織中高表達,與腫瘤細胞的生長調節密切相關[1]。本研究用免疫組化SP法檢測肺癌中的APRIL蛋白表達情況,并分析高表達的APRIL與肺癌臨床病理特征的關系,為研究APRIL在肺癌發生發展中的作用及預后提供實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 石蠟標本取自南通大學附屬醫院病理科2003年4月至2007年6月間的肺癌病例82例,其中男50例,女32例,年齡34～75歲,平均59.7歲。每例均重新復習閱片。組織病理分型:非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)72例,包括鱗癌 35例,腺癌 33例,大細胞肺癌 4例;小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)10例。病理分級:高中分化53例,低分化29例。TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期67例,Ⅲ～Ⅳ期15例。無淋巴結轉移者42例,有淋巴結轉移者40例。同時選取5例炎性假瘤和16例正常肺組織做對照。術前均未接受放療、化療和免疫治療,標本用10%甲醛固定,常規脫水后石蠟包埋,病理診斷無異議。所有標本組織學分類和診斷均按WHO診斷標準,TNM分期根據UICC劃分。

1.2 試劑與方法 濃縮型兔抗人APRIL多克隆抗體(美國,芝加哥),使用濃度2μ g/mL。即用型SP法免疫組化檢測試劑盒(美國GBI公司),DAB顯色試劑盒(北京中山生物有限公司)。將入選的所有組織蠟塊每一個均連續切片2～3張、切片厚度5μ m,其中1張行HE染色,其余用SP免疫組化方法檢測。用已知陽性切片做陽性對照,用PBS代替一抗作陰性對照,檢測程序嚴格按產品說明書進行。

1.3 結果判斷 以細胞質內或細胞質內和細胞膜上同時出現淡黃至棕黃色顆粒者記為APRIL陽性細胞,以陽性細胞占所觀察細胞的百分比及著色強度綜合計分做半定量分析。采用Allred′s[2]評分法,將陽性細胞數分為 6個級別:0,無細胞染色;1,＜1%的細胞染色;2,1%～10%的細胞染色;3,11%～33%的細胞染色;4,34%～66%的細胞染色;5,＞67%的細胞染色。細胞染色強度分為 4個級別:0,陰性(無染色);1,弱陽性(淡黃色);2,陽性(黃色);3,強陽性(棕黃色)。隨機選擇有代表性的10個高倍鏡視野,每個視野記數100個腫瘤細胞,將兩項指標的評分相加,根據總的分數分為3個級別:0分為陰性,1～6分為陽性,7～8分為強陽性。所有切片染色結果均經病理醫生雙盲法進行判定。

1.4 統計學方法 應用SPSS 11.5統計軟件,采用Pearson χ2檢驗進行統計學分析,以P＜0.05作為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同肺癌組織類型APRIL表達 免疫組織化學染色可見APRIL陽性表達主要定位于NSCLC(鱗癌、腺癌和大細胞癌)患者癌細胞的陽性細胞胞質/胞膜上(圖1A、B、C),SCLC、炎性假瘤和正常組織中少見或陰性表達(圖1D、E、F)。72例NSCLC中63例APRIL陽性表達(87.5%),10例SCLC中1例陽性表達(10%),5例炎性假瘤和16例正常組織中APRIL全為陰性表達,不同肺組織中APRIL蛋白表達陽性率比較見表1。

圖1 免疫組化SP法檢測肺癌組織中APRIL蛋白表達(中倍放大)

2.2 NSCLC中APRIL表達與臨床病理特征的關系 結果如表2所示,APRIL蛋白表達與性別、年齡、組織學分型無關(均P＞0.05),與淋巴結轉移(P=0.035)、腫瘤病理分級(P=0.000)和 TNM分期(P=0.000)明顯相關。

表1 不同肺組織中APRIL蛋白表達陽性率比較

表2 APRIL蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系〔n(%)〕

3 討 論

APRIL是腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor,TNF)的一員,1998年首先由 Hahne等[1]發現并克隆成功,在正常組織僅有少量表達,而在腫瘤特別是消化道腫瘤中呈高表達,可通過旁分泌或自分泌兩種方式促進腫瘤的發生發展。有研究證實,APRIL在體外可誘導激活NF-kB通路刺激腫瘤細胞的增殖[3-4],并且腫瘤細胞本身也能夠表APRIL[5-6],通過RFQ-PCR(fluorescent quantitative real time-PCR)方法對肝癌、胃癌的癌組織及遠端正常組織APRIL mRNA的檢測發現,其在癌組織的表達量明顯高于健康組織[7-8],這些結果提示APRIL與腫瘤發生、發展相關,并可作為腫瘤發生的檢測診斷指標。

本研究采用免疫組化技術檢測APRIL蛋白在肺癌中的表達,發現APRIL主要定位于癌細胞的細胞膜和(或)胞漿中,APRIL在NSCLC表達陽性率明顯高于SCLC和正常組織(P＜0.05),而在SCLC中未見明顯異常,提示APRIL在肺癌尤其在NSCLC中高表達,這一結果與施健等[8]從mRNA水平探討APRIL在肺癌組織中高表達基本一致。APRIL在NSCLC和SCLC中的表達差異,可能與不同癌細胞來源有關,至于產生這種差異的分子機制,尚須深入研究。

在分析APRIL蛋白表達與患者臨床病理資料的關系中,發現APRIL表達與肺癌淋巴結轉移、病理分級、TNM分期有關,APRIL表達陽性率在淋巴結轉移組顯著高于無淋巴結轉移組(P＜0.05),低分化組顯著高于高中分化組(P＜0.01),Ⅲ、Ⅳ期患者中的表達強度和陽性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＜0.01),表明APRIL與肺癌組織惡性生長和臨床進展之間存在著一定關系,隨著肺癌病變的加重,以及淋巴結轉移的發生,APRIL的陽性表達率增高,提示APRIL陽性表達與非小細胞肺癌進展、侵襲、轉移能力的增強有關,表達APRIL的腫瘤細胞更具侵襲力。本課題組前期實驗通過運用 RNA干擾技術,發現APRIL基因參與結直腸癌細胞的侵襲和轉移。Okano等[9]在研究APRIL在人肝細胞癌中的作用時發現APRIL不但能促進肝癌細胞的增殖,還能誘導肝癌細胞株SKHep1和HepG2中血管內皮生長因子(VEGF)表達上調,最終促進肝癌的侵襲發展。因為腫瘤細胞可以大量分泌VEGF,VEGF在腫瘤間質的形成和新生血管形成中起關鍵作用,并且與腫瘤浸潤和轉移有關[10]。董桂芝等[11]用酶聯免疫法(ELISA)檢測189例初診肺癌患者sVEGF水平,發現 sVEGF亦與臨床分期密切相關,Ⅲ、Ⅳ期患者sVEGF的水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者,也有研究者利用血清測定VEGF發現肺癌患者血清中 VEGF水平明顯升高[12]。這些結果都提示 APRIL在癌癥的發展和侵襲轉移中的作用與VEGF的表達上調密切相關。因此作者認為,APRIL在肺癌中尤其在NSCLC中高表達,而且與NSCLC發展和侵襲轉移有著密切關系,為肺癌發生、發展的機制研究和預后提供了可靠的實驗基礎。

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[12]陳敬,陳正堂,鄒嵐,等.非小細胞肺癌患者外周血VEGF、CK19mRNA、CEA 和 TSGF聯合檢測的意義[J].重慶醫學,2004,33(7):977.