含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒樣顆粒的制備及應用*

戚宇華,崔侖標,史智揚,葛以躍,李 顯,張文帥,單 軍,汪 華

含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒樣顆粒的制備及應用*

戚宇華,崔侖標,史智揚,葛以躍,李 顯,張文帥,單 軍,汪 華

目的構建耐RNase酶的內含禽流感病毒 H5N1亞型部分核酸序列的病毒樣顆粒。方法構建中間載體pET32a-MS2,將禽流感病毒H5N1亞型的HA、NA和M基因片斷連接到中間載體上,構建原核表達載體pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA和pET32a-MS2-M,分別轉化宿主菌,誘導表達制備病毒樣顆粒。結果表達載體經PCR、酶切鑒定和測序分析后證實構建成功。電鏡觀察到了病毒樣顆粒,熒光定量RT-PCR試驗表明顆粒穩定性良好。結論成功構建了含禽流感病毒H5N1部分核酸序列的病毒樣顆粒且穩定性良好,可作為禽流感H5N1亞型RNA檢測的標準品和質控品。

MS2噬菌體;禽流感病毒 H5N1;病毒樣顆粒;原核表達

近年來禽流感病毒在世界范圍內的流行引起了人們的高度重視,每年冬春季是禽流感爆發的高峰期,其中H5N1亞型的死亡率特別高,為高致病性禽流感病毒〔1-2〕。除禽類外它可以感染包括人在內的許多哺乳動物〔2-3〕。2009年初,中國就出現了8例人感染禽流感H5N1亞型的散發病例,其中5人死亡,給人民生命財產造成重大危害。對禽流感病毒的快速實驗室檢測并確診,對于挽救病人生命,及時處理續發病例,有效控制疾病的流行起著非常重要的作用。目前,世界各國廣泛應用RT-PCR的方法來檢測禽流感H5N1亞型病毒感染的臨床標本〔3-4〕。然而RNA病毒在PCR基礎上的定性和定量檢測中,常會有假陰性的出現,在臨床檢測中人們關心的是檢測試劑盒中的陽性是否有傳染性,或者能否起到全程監控的作用。所以對 H5N1亞型病毒的核酸測定質控品和標準品的研制尤為重要。Armored RNA的技術是解決標準品的途徑之一。本研究我們采用Armored RNA的設計方法〔5-7〕制備了H5N1禽流感病毒血凝素基因HA,神經氨酸酶基因NA和M蛋白基因片斷的病毒樣顆粒。這些病毒樣顆粒能有效抵抗RNase酶引起的降解,可作為檢測H5N1禽流感病毒基因RT-PCR的質控品,并能對從核酸提取到RT-PCR檢測全過程起到有效的監控作用。

1 材料和方法

1.1 病毒來源 禽流感H5N1亞型病毒毒株由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 BL21(DE3)E.coli、Top10E.coli及pET32a質粒為本室保存菌株,pMS27質粒由廈門大學惠贈。Taq DNA聚合酶、DNA連接酶試劑盒 、Hind III、BamH I 試劑盒 、質粒純化試劑盒 、核酸提取試劑盒(TaKaRa公司);膠回收試劑盒(O-mega公司);OneStep RT-PCR試劑盒(Qiagen公司);熒光定量OneStep Probe Master Mix(Qiagen公司)。

1.3 方法

1.3.1 引物設計 根據大腸桿菌MS2噬菌體裝配蛋白和殼蛋白基因和禽流感病毒H5N1亞型的 M蛋白基因,血凝素基因HA和神經氨酸酶基因NA序列,設計引物,序列如下:

MS2 的 上 游 引 物 為 5′-ATATGGATCCCCCTT TCGGGGTCCTGCTC-3′,下游 引物 為 5′-CGCAAGCT TTCT TCGACATGGGTAATCCT-3′,目的擴增片段為1 700bp;M的上游引物為5'-CAGAAGCTTGACCAATCCTGTCACCTCTGAC-3',下 游 引物 為 5'-GTGAAGCTTGGGCATTCTGGACAAAGCGTCTACG-3',目的擴增片段為104bp;HA的上游引物為 5'-GCGGAAGCT T TGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGT-3',下游引物為 5'-GTGAAGCTT TGAT TGCCAGTGCTAGGGAACT-3',目的擴增片段為158bp;NA的上游引物為5'-GAGAAGCTT TGT TGCTTGGTCAGCAAGTGCT-3',下游引物為 5'-GGCAAGCT TGAGTTCTCAGTATGTTGT TCC-3',目的擴增片段為152bp。所有引物均在Primer Premier 5軟件上設計引物并在上、下游引物 5'端引入GGATCC(BamH I酶切位點)和AAGCTT (Hind III酶切位點),并由上海生工公司合成。病毒樣顆粒熒光定量PCR檢測的引物探針由中國預防控制中心提供。

1.3.2 中間載體pET32a-MS2的構建 以pMS27質粒為模板PCR擴增MS2基因片段,PCR體系中含上下游引物各2.5 pmol/L,TaqDNA Polymerase 2.5U,dNTP 2.5mmoL/L,模板 1μ L,MgCl245 mmoL/L,雙蒸水補足 30μ L。PCR反應條件為:95℃變性 5 min,然后 94℃30 s,57℃30 s,72℃1 min 30 s,進行35個循環,最后72℃延伸10 min。擴增產物經Hind III和BamH I雙酶切后產物1.0%瓊脂糖凝膠電泳,Omega膠回收試劑盒回收MS2基因片段。和同樣雙酶切的pET32a載體16℃連接1 h,連接產物轉化TOP10感受態細胞,涂板后挑取單克隆培養擴增,提取質粒進行PCR及酶切鑒定,鑒定為陽性的重組載體命名為pET32a-MS2。

1.3.3 原核表達載體pET32a-MS2-M,pET32a-MS2-HA和 pET32a-MS2-NA的構建 分別以禽流感H5N1亞型病毒毒株 RNA為模板,OneStep RT-PCR試劑盒擴增3種基因片段,RT-PCR反應條件為:50℃30 min,95℃變性15 min,然后94℃30 s,58℃30 s,72℃30 s,35個循環,最后72℃延伸10 min。擴增產物經Hind III單酶切后2.0%瓊脂糖凝膠電泳,Omega膠回收試劑盒分別回收M、HA和NA的基因片段,與同樣Hind III單酶切的pET32a-MS2載體連接。連接產物轉化TOP10感受態細胞,涂板后挑取單克隆培養,提取質粒進行PCR及酶切鑒定,并送上海生工測序,序列正確的重組載體分別命名為 pET32a-MS2-M,pET32a-MS2-HA和pET32a-MS2-NA。

1.3.4 病毒樣顆粒的誘導表達 將測序正確的上述3種質粒分別轉化表達菌株BL21(DE3),將陽性克隆菌株接種于氨芐抗性的LB液體培養基中,37℃振蕩培養至OD600=0.5～0.6,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,誘導表達6 h后,離心收集菌體,超聲破碎后,離心取上清到另一干凈的離心管,得到粗制的病毒樣顆粒產物。

1.3.5 病毒樣顆粒熒光定量RT-PCR檢測 取適量粗制病毒樣顆粒溶液250μ L用Takara核酸提取試劑盒提取RNA,3種病毒樣顆粒RNA用Qiagen OneStep Probe Master Mix檢測試劑盒,在 Roto Gene 3000做熒光定量PCR,PCR反應條件為:50℃30 min,95℃變性15 min,然后 94℃15 s,60℃1 min,72℃30 s,進行45個循環。檢測定量RT-PCR的結果。

1.4 病毒樣顆粒的純化和形態觀察 取適量粗制病毒樣顆粒溶液NA加入DNase I和RNase A(終濃度 1μ g/mL),室溫溫育 30 min后離心(4℃,10min,11 000g)去除細胞碎片。上清與42%的氯化銫溶液混勻,配制成p=1.4550g/mL的溶液,日立SCP85H超速離心機 RPS40T轉頭做梯度離心(4℃,48 h,160 000g),離心管底部扎孔,分段收集梯度。蛋白核酸分析儀選取目標梯度加PBS混勻,離心(4℃,2 h,110 000g)去除氯化銫,適量PBS懸浮。將懸浮液用2%的磷鎢酸負染,H7650透射電鏡觀察純化的病毒樣顆粒。

1.5 病毒樣顆粒的穩定性試驗 各取100 μ L病毒樣顆粒溶液NA加入過量的RNaseA,分別放置在37℃,4℃,-20℃,放置 1d,7d,14d和 30d,然后提取 RNA,再用 Qiagen OneStep Probe Master Mix檢測試劑盒,在Roto Gene 3000做熒光定量PCR。PCR反應體系中上下游引物及探針各5 pmol/L,RT-Mix Enzyme 0.25μ L,模板 5μ L,雙蒸水補足25μ L。PCR反應條件同上。

2 結果與分析

2.1 中間載體pET32a-MS2的鑒定 將連接產物pET32a-MS2轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞,隨機挑3個單克隆進行PCR鑒定,結果全為陽性。取其中1個陽性克隆搖菌提取質粒,用Hind III和BamH I雙酶切,電泳鑒定有約1 700 bp的目的條帶(圖1)。結果表明MS2基因片段正確克隆到載體pET32a上。

圖1 重組質粒pET32a-MS2的酶切鑒定Fig.1 Enzymolysis identification of the recombinant plasmid pET32a-MS2

2.2 表達載體 pET32a-MS2-M,pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA的鑒定 將連接產物pET32a-MS2-M,pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA分別轉化大腸桿菌 TOP10感受態細胞。挑取單克隆進行PCR鑒定,結果全為陽性。分別取其中一陽性克隆搖菌提取質粒用Hind III單酶切,電泳鑒定有100 bp左右的目的基因條帶,M為104 bp,HA為158 bp,NA為152 bp;用Hind III和BamH I雙酶切,電泳鑒定有100bp左右的目的基因條帶外,同時有 1 700 bp的MS2基因條帶(圖2),結合測序結果表明M,HA和NA片段正確克隆到載體pET32a-MS2上。

圖2 pET32a-MS2-M,pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA的酶切鑒定Fig.2 Enzymolysisidentification ofexpression vector pET32a- MS2-M, pET32a- MS2-HA, and pET32a-MS2-NA

2.3 病毒樣顆粒的熒光定量RT-PCR結果 3種病毒樣顆粒溶液提取RNA,再用Qiagen熒光定量試劑盒擴增3種禽流感病毒基因,熒光定量 RTPCR結果均為陽性(圖3),表明病毒顆粒含有禽流感H5N1亞型的M,HA和NA的RNA序列。

圖3 病毒樣顆粒熒光定量RT-PCR鑒定結果Fig.3 The realtime RT-PCR result of virus-like particles

2.4 病毒樣顆粒的形態觀察 粗制的病毒樣顆粒NA經氯化銫梯度離心后,PBS離心去除氯化銫后,經透射電鏡觀察,可見表達產物為直徑50nm左右的圓形顆粒,即誘導表達得到的病毒樣顆粒(圖4)。

圖4 病毒樣顆粒的電鏡觀察結果Fig.4 The electron microscope result of virus-like particles

2.5 病毒樣顆粒的穩定性 取病毒樣顆粒NA溶液加入過量的 RNaseA消化后,分別放置在37℃,4℃,-20℃,放置 1d,7d,14d和 30d,得到幾種不同條件下的樣品,分別提取RNA,熒光定量RT-PCR得到不同樣品的Ct值(圖5)。結果表明,在-20℃時,放置超過30 d Ct值基本不變,而放置在4℃和37℃條件下的樣品隨時間增長Ct值略有增加,穩定性試驗證明制備的病毒樣顆粒能夠抵抗核糖核酸酶引起的RNA降解,穩定性良好。

圖5 病毒樣蛋白顆粒的穩定性分析Fig.5 Analysis of stability of virus-like particles

3 討 論

20世紀來全世界范圍爆發人感染禽流感病毒越來越多。1997年我國香港發現的H5N1亞型高致病性禽流感引起18人感染并導致6人死亡更引起全世界人民的高度重視〔8〕。而世界衛生組織(WHO)也報道了多起人感染高致病性禽流感H5N1,一些在家庭成員中人感染人的病例在越南和臺灣也有報道〔9〕。目前RT-PCR的核酸檢測是主要的快速檢測方法。在禽流感H5N1亞型的核酸檢測中還缺乏從核酸提取到定量PCR的全程陽性質控品。

近年來運用Armored RNA的技術來制備質控品越來越多。在早期的研究中發現MS2噬菌體基因編碼成熟酶蛋白、外殼蛋白、復制酶蛋白和裂解蛋白4種蛋白分子〔10〕。MS2噬菌體的外殼蛋白與操作子RNA一段莖環結構有特異性的相互作用,使噬菌體外殼蛋白組裝成病毒樣顆粒,基因組RNA也被包裝進去〔11-12〕。將MS2噬菌體的外殼蛋白等基因和外源性基因片段插入到原核表達載體中,這一載體能夠將這些片段轉錄成RNA,并利用載體上MS2外殼蛋白基因合成的外殼蛋白將重組RNA裝配成球狀的 RNA蛋白復合體,即病毒樣顆?！?3〕。本研究在此基礎上,首先構建了中間載體pET32a-MS2,然后將禽流感病毒H5N1亞型的M蛋白基因、血凝素基因HA、神經氨酸酶基因NA序列分別克隆到載體的噬菌體基因的下游,進行原核表達得到含有禽流感H5N1亞型的M、HA和NA的基因序列的病毒樣顆粒。

本試驗室構建這種禽流感H5N1亞型RNA病毒樣顆粒有著極重要的意義。首先解決了安全性問題,這種重組的病毒顆粒無傳染性,可廣泛應用于普通試驗室檢測。此外這種病毒樣顆粒具有耐RNase酶的特性,它比較穩定,在4℃、37℃保存30d后提取RNA做熒光定量RT-PCR仍然沒有降解。很好地解決了普通RNA作為質控品很快降解且不易保存和運輸的穩定性問題。由于這種病毒顆粒是蛋白外殼包裹核酸,與大多數RNA病毒相似,可以與樣品一樣經歷核酸提取,反轉錄,PCR擴增的全過程,避免了假陰性的結果。本研究采用分子克隆和原核誘導表達構建的禽流感H5N1亞型RNA病毒樣顆?？梢栽赗T-PCR、熒光定量RT-PCR的檢測中作為穩定的質控品和標準品,在RNA檢測中具有很大的發展前景。

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Preparation of the RNAse-resistant virus particles containing the partial gene fragments of avian influenza virus H5N1 and its application

QI Yu-hua,CUI Lun-biao,SHI Zhi-yang,GE Yi-yue,LI Xian,ZHANG Wen-shuai,SHAN Jun,W ANG Hua

(Microbiological laboratory,Jiangsu Provincial Center for Diseases Prevention and Control,Nanjing210009,China)

To prepare the RNAse-resistant virus particles containing the partial gene fragments of avian influenza virus H5N1 for use as RNA standard and control in RNA virus detection,the genes coding the coat protein and maturase ofE.colibacteriophage MS2 were amplified by PCR and then cloned into prokaryotic expression vector pET32a to construct the intermediate vector pET32a-MS2.In addition,the gene sequences coding hemagglutinin(HA),neuraminidase(NA)and M protein of the H5N1 virus were also cloned separately to the down-stream of plasmid pET32a-MS2,thus constructing the prokaryotic expression vectors pET32a-NS2-HA,pET32a-MS2-NA and pET32a-MS2-M.These recombinant plasmids were then transformed separately toE.coliBL21(DE3)with induction by IPTG.to express the virus-like particles.The virus-like particles observed under electron microscopy were identified by RT-PCR,while their stability was confirmed by real-time RT-PCR.In this way,the virus-like particles were successively constructed and identified through PCR amplification,enzymolysis identification and sequencing analysis.These virus-like particles observed under electron microscopy appeared to be circular in shape with a diameter of about 50 nm.Their stability was proved to be rather good.From these observations,it is apparent that these virus-like particles can be used as RNA standard and quality control in the detection of avian influenza virus H5N1.

bacteriophage MS2;H5N1 avian influenza virus;virus-like particles;prokaryotic expression vector

R373.1

A

1002-2694(2010)01-0029-04

*江蘇省國際科技合作項目(BZ2008068)

史智揚,Email:njyhqi@126.com

衛生部腸道病毒重點實驗室,江蘇省疾病預防與控制中心檢驗科,南京 210009

2009-10-09;

2009-12-03