牛冠狀病毒N基因的原核表達及初步應用*

劉合義,余麗蕓,侯喜林,孫留霞,周玉龍,王進軼,劉雙翼,樸范澤

牛冠狀病毒N基因的原核表達及初步應用*

劉合義,余麗蕓,侯喜林,孫留霞,周玉龍,王進軼,劉雙翼,樸范澤

目的獲得牛冠狀病毒N基因的全長序列,實現N基因在大腸桿菌中的高效表達,并進行初步應用。方法根據已發表的牛冠狀病毒M ebus株的序列設計引物,對BCV-DQ株進行RT-PCR擴增、克隆和測序;將該基因插入到原核表達載體pET-30a(+)上進行原核表達,SDS-PAGE和Western blot檢測;用純化的重組N蛋白作為包被抗原,建立ELISA檢測方法,對部分臨床樣本進行檢測。結果BCV-DQ株N基因全長1 347bp,與GenBank已發表的6株BCV的N基因相比較,核苷酸同源性98.3%以上。構建的重組質粒pET-N能表達出一條大小約為60 ku的蛋白,且能與鼠抗BCV血清發生特異性反應。用建立的ELISA方法對黑龍江不同地區送檢的共256份牛血清樣品進行檢測,結果陽性率65.23%,與病毒中和試驗的符合率達95.31%。結論BCV N基因保守性很高,并在原核表達系統中獲得了高效表達,其表達產物具有良好的免疫反應原性。臨床檢測結果表明N蛋白可作為診斷抗原用于牛冠狀病毒病的流行病學調查。

牛冠狀病毒;N基因;克隆;序列分析;原核表達

牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus,BCV)是冠狀病毒科冠狀病毒屬成員,為不分節段的單股正鏈RNA病毒,是引起犢牛腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道疾病的主要病原〔1〕。冠狀病毒屬成員分為4個抗原群:第1群包括人冠狀病毒HCV-229E、豬傳染性胃腸炎病毒、犬冠狀病毒等;第2群包括BCV、豬血凝性腦脊髓炎病毒、小鼠肝炎病毒、人冠狀病毒HCoV-OC43等;第3群成員有傳染性支氣管炎病毒等;第 4群為SARS冠狀病毒〔2-3〕。BCV基因組大小約32 kb,編碼5種主要結構蛋白,即纖突蛋白(S)、核蛋白(N)、膜蛋白(M)、小膜蛋白(E)和血凝素酯酶蛋白(HE)〔4〕。其中核衣殼蛋白基因(N)是BCV主要結構蛋白基因,與基因組RNA組裝成核糖核蛋白復合物〔5〕。N蛋白不僅在病毒致病性、轉錄和翻譯及增強細胞免疫等方面也起到重要作用,而且具有輔助增強病毒 RNA復制的能力〔6-7〕。N基因高度保守,可作為診斷BCV的候選基因〔8〕。

本研究欲對BCV-DQ株N基因進行克隆和序列分析,同時對N基因進行原核表達和純化,獲得具有特異性的診斷抗原,建立ELISA方法并對臨床標本進行初步檢測。

1 材料和方法

1.1 病毒、細胞、菌株和質粒 BCV-DQ株、表達載體pET-30a(+)、宿主菌 DH5α、BL21(DE3)由本實驗室保存。HRT-18(人直腸癌細胞)購自中科院上海細胞庫。

1.2 試劑 pMD18-T載體、TaqDNA聚合酶、dNTP、RNA 酶抑制劑、M-MLV、限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ等購自Fermentas公司;Trizol Reagent購自 Invitrogen 公司 ;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒均為大連寶生物工程有限公產品;羊抗鼠IgG-HRP購自Sigma公司;DAB購自AMRESCO公司;其他試劑均為分析純試劑。

1.3 試驗動物 BALB/c小鼠由長春實驗動物中心提供。

1.4 引物設計與合成 根據GenBank中已發表的BCV U00735 Mebus株 N基因全序列,利用DNAStar和Prime 5.0設計1對引物,在上游引物中引入BamHⅠ限制性內切酶位點,在下游引物中引入XhoⅠ限制性內切酶位點(酶切位點用斜體加粗標記),預計擴增片斷為1 347 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。序列如下:

1.5 病毒RNA的提取 用 Trizol試劑提取病毒總 RNA 。取細胞病毒液約 200 μ L,加入 600 μ L Trizol,振蕩 30 s,靜置 2～ 3 min;加入氯仿 200 μ L,靜置待其分層,然后12 000 r/min離心15 min;這時液體分成3層,最上層為 RNA層,中間為蛋白層,最下層為DNA層,小心吸取 RNA層,移入另一離心管中;500 μ L異丙醇加入含有RNA的離心管中混勻,靜置10 min,12 000 r/min離心 10 min,小心吸棄液體;向沉淀加入75%乙醇1 mL,混懸沉淀,然后7 500 r/min離心5 min;吸棄乙醇,放入真空干燥機5 min,使管內殘留的乙醇揮發,但要避免過分干燥 RNA;加入20 μ L無 RNA酶的去離子水溶解核酸,-70℃保存或直接做反轉錄。

1.6 目的基因的擴增、克隆及序列分析

1.6.1 反轉錄合成 cDNA 吸取5 μ L提取的RNA樣品溶液放于離心管中,加入3 μ L下游引物,3 μ L 無 Rnase 水,70℃預熱5 min,冰浴5 min,依次加入 4μ L 5 ×反轉 錄緩 沖液 、3 μ L 10mmol/L dNTPs 、1μ L Rnasin(40U/μ L)、1μ L M-MLV,總體積 20 μ L,42℃溫浴 1h 。

1.6.2 PCR擴增反應體系(25 μ L) 10×PCR Buffer緩沖液 2.5 μ L,dNTP 2 μ L,上下游引物各 1 μ L,Taq DNA 聚合酶 0.5μ L,模板 2 μ L,加水至 25 μ L。同時設陰性對照。循環參數為:94℃5min,94℃1 min,58℃1min30s,72℃2 min,共35個循環,最后72℃延伸10 min。

1.6.3 N基因克隆及序列分析 將PCR產物純化回收,并與pMD18-T載體連接,轉化DH5α感受態細胞,用含Amp+的 LB瓊脂平板篩選,提取質粒,酶切鑒定重組質粒,陽性克隆命名為pMD-N,送上海生工測序。對測序結果用DNAstar軟件進行序列分析。

1.7 重組原核表達載體的構建 用BamHⅠ和XhoⅠ從pMD-N質粒上雙酶切下目的基因片斷,純化回收后與同樣雙酶切的pET-30a(+)載體相連,轉化入BL21感受態細胞,用含卡那霉素的LB瓊脂平板篩選,挑取單個白色菌落于37℃過夜培養后抽提質粒,經酶切鑒定為陽性的重組質粒命名為pET-N。

1.8 重組質粒在大腸桿菌中的表達及SDS-PAGE凝膠電泳〔9〕將 pET-N陽性質粒轉化至 BL21(DE3)中,挑取單個菌落接種含卡那霉素(30 mg/L)的LB培養基中,于37℃振蕩培養至OD600nm為0.6～1.0時,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導表達目的蛋白,并分別在3 h、4 h和5 h時取1.0 ml菌液,同時收集未誘導的菌液作為陰性對照,對經轉化BL21的空載體也以相同的條件誘導,作為對照。于12%SDS-PAGE分離膠上進行電泳分析。

1.9 表達蛋白的回收與純化 參照分子克隆實驗指南〔10〕,利用電洗脫的方法純化蛋白。

1.10 制備鼠抗BCV陽性血清 取經過蔗糖密度離心純化的BCV病毒液1 mL與等量弗氏完全佐劑混合,制成乳化劑。第1次免疫給BALB/c健康小鼠腹腔注射乳化劑(0.3mL/只),然后每隔2周用不完全弗氏佐劑加強免疫1次,免疫劑量、途徑與第一次相同。第3次免疫后7 d采血、分離血清,置-20℃保存備用。

1.11 重組蛋白的Western blot鑒定 將純化后的融合蛋白進行 Western blot檢測鑒定。將 SDSPAGE蛋白帶轉移至硝酸纖維素膜,用含5%脫脂奶粉的PBST封閉,以鼠抗BCV血清為一抗,羊抗鼠IgG-HRP為二抗,DAB染色。

1.12 臨床初步應用 用純化的N蛋白作為包被抗原,通過方陣試驗確定了抗原的最適包被濃度為1.75 μ g/mL,血清最佳稀釋倍數為1∶200,酶標二抗最佳稀釋倍數為1∶8 000,初步建立了檢測牛冠狀病毒抗體的間接ELISA方法。對黑龍江省內不同地區共256份牛血清樣品進行檢測,并與中和試驗進行比較,計算其符合率。

2 結 果

2.1 N基因的擴增和克隆 RT-PCR擴增出約1 347bp左右大小的片段,與預測結果一致(圖1)?；厥諗U增產物,克隆到pMD18-T載體中,得到重組質粒pMD-N,經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定正確(圖2)。2.2 序列測定與分析 我們將N序列提交Gen-Bank,獲得 Accession:FJ556872。用 DNAStar軟件分析測序結果,與GenBank上BCV各株之間的同源性比較得出,BCV-DQ株與USA(AF058942株)的同源性在100%,與BCoV-ENT(AF391541)的同源性在98.3%,與參考株Mebus U00735的同源性在99.3%,與Germany(EF193073)株的同源性在 99.2%。與呼吸道分離株 BCoV-LUN(AF391542)株的同源性在98.4%。

將其它冠狀病毒N基因序列從GenBank下載后用DNAStar軟件進行多重比對,構建出了進化關系樹,由圖3可見BCV與人冠狀病毒OC43及人腸道冠狀病毒4408親緣關系最為接近。

圖3 冠狀病毒N基因進化關系樹Fig.3 Phylogenetic tree of N genes fromdifferent coronavirus.

通過DNAStar Protein程序對推導的N基因氨基酸序列的親水性、抗原性和表面可能性預測,發現100～111、269～280、390～410和415～429區段顯示出很高的親水性、抗原指數和表面可能性

(如圖4)。

圖4 N蛋白的親水性、抗原指數及表面可能性分析Fig.4 Hydrophilicity plot,antigenic index and surface probability plot for N protein.

2.3 重組表達質粒的酶切鑒定 將所獲得的重組表達質粒pET-N用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定,酶切結果與預期大小相符(圖5)。

2.4 SDS-PAGE電泳及目的蛋白的回收、純化結果 N基因表達產物SDS-PAGE電泳后,經染色、脫色,發現含重組質粒的誘導菌在60 ku處出現一條特別粗的蛋白帶,大小與融合蛋白的理論值一致,隨著誘導時間的增加,其表達量隨之增加,在5 h時達到最大值,而未誘導的重組質粒轉化菌和空載體質粒轉化菌沒有出現相同的條帶(圖6)。用電洗脫方法回收、純化的蛋白,純度較高,結果見圖7。

2.5 重組蛋白的免疫活性鑒定 經Western blot鑒定(如圖8),純化的表達產物與鼠抗BCV血清發生反應,而未經重組的菌體不發生反應。

圖8 重組蛋白的Western blot鑒定Fig.8 Western blot analysis of the expressed product

2.6 臨床初步應用 對黑龍江不同地區送檢的共256份牛血清樣品的檢測結果(表1)顯示陽性樣品167份,陽性率65.23%,與病毒中和試驗方法的檢測結果符合率達95.31%。

表1 重組N蛋白-ELISA的檢測應用Table 1 Application of recombinant N protein based ELISA

3 討 論

本試驗采用RT-PCR技術擴增了BCV-DQ株的N基因全長序列并克隆入pMD18-T載體中,通過鑒定后再亞克隆入pET-30a(+)表達載體中構建了重組表達載體。核苷酸序列測定顯示擴增片段長度為1 347 bp,包括完整的N基因開放閱讀框,N基因全長為1 347 bp,編碼448個氨基酸。核苷酸序列與GenBank所發表的其它BCV序列的同源性可達98.3%以上,氨基酸同源性在98.7%以上,證明N基因的序列非常保守,與 Lapps等〔8〕、Arnold等〔11〕的報道一致。選擇表達的 N蛋白建立的ELISA方法可用于BCV臨床診斷及血清流行病學調查。

將其它冠狀病毒N基因序列從GenBank下載后進行同源性比較,利用DNAStar軟件繪制的冠狀病毒進化關系樹與 2001年國際病毒分類委員會(ICTV)公布的關于BCV的分類群相符合。BCV與人的冠狀病毒OC43的同源性最高,表明了BCV存在感染人的可能性。國內外不少研究者從人血清中檢測到了BCV抗體,進一步證實了BCV可能感染人〔12-13〕。在臨床樣品檢測中也發現了這一特點,如鼠和大鼠、雞和火雞、人和冠狀病毒存在宿主轉移現象〔14〕。

用DNAStar Protean程序推測、分析N蛋白的親水性、抗原性和表面可能性,在 100～111、269～280、390～410和 415～429區段的親水性指數、抗原指數較高,其呈現在蛋白表面的可能性也比較大,推測這幾段區域可能是N蛋白的主要抗原位點。

本試驗將成功擴增的BCV N基因插入到原核表達載體pET-30a上,在E.coliBL21(DE3)工程菌株內成功進行了表達。Western blot分析結果證明該蛋白具有良好的反應原性。原核表達載體pET-30a可高效穩定表達外源蛋白,并具有表達量高、純化工序簡單、成本低廉的優點,便為臨床樣本檢測制備相應的抗原。用純化的重組N蛋白對256份送檢血清的檢測,結果進一步證明,N蛋白可以作為診斷抗原用于牛冠狀病毒病的流行病學調查。

〔1〕殷震,劉景華.動物病毒學 〔M〕.2版.北京:科學出版社,1997:697-698.

〔2〕Spaan W,Cavanagh D,Horzinek MC.Co ronaviruses:structure and genome expression 〔J〕.Journal of General Virology,1988,69(12):2939 2952.

〔3〕Brian DA,Baric RS.Coronavirus genome structure and replication〔J〕.Curr Top Microbiol Immunol,2005,287:1-30.

〔4〕T akiuchi E,Stipp DT,Alfieri AF,et al.Improved detection of bovine coronavirus N gene in faeces of calves infected naturally by a semi-nested PCR assay and an internal control〔J〕.Journal of Virological M ethods,2005,131(2):148-154.

〔5〕Almazan FC,Enjuanes G L.T he nucleoprotein is required for efficient coronavirus genome replication〔J〕.Journal of Virology,2004,78(22):12683-12688.

〔6〕Harry V,Gert J,J Rossen.Nucleocapsid-independent assembly of coronavirus-like particles by co-expression of viral envelope protein genes 〔J〕.TheEMBO Journal,1996,15(8):2020-2028.

〔7〕Savithra DS,M artin AH,Joanne L,et al.The Nucleocapsid protein gene of bovine coronavirus is bicistronic〔J〕.Journal of virology Sept,1992,66(9):5277-5283.

〔8〕Lapps W,Hogue BG,Brian DA.Sequence analysis of the bovine coronavirus nucleocapsid and matrix protein genes〔J〕.Virology,1987,157(1):47-57.

〔9〕李江濤.狂犬病病毒CVS株核蛋白基因的原核表達、純化及鑒定〔J〕.生物技術通報,2008,3:103-106.

〔10〕薩姆布克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆實驗指南〔M〕.2版.北京:科學出版社,1993:11.

〔11〕 Arnold V,Peter T.Sequence analysis of the turkey enteric coronavirus nucleocapsid and membrane protein genes:a close genomic relationship with bovine co ronavirus〔J〕.Journal of General Virology,1991,72(7):1659-1666.

〔12〕姚火春,杜念興,徐為燕,等.牛冠狀病毒的血清流行病學調查〔J〕.南京農業大學學報,1990,l3(2):l17-121.

〔13〕Storz J,Rott R.Reactivity of antibodies in human serum with antigens of an enteropathogenic bovine coronavirus〔J〕.Medical Microbiology and Immunology,1981,169(3):169-178.

〔14〕Eric J,Peter J,Bredenbeek.Unique and conserved features of genome and proteome of SARS-co ronavirus an early Split-off from the coronavirus group 2 Lineage〔J〕.J Mol Biol,2003,331(5):991-1004.

Prokaryotic expression of the nucleocapsid protein gene in bovine coronavirus and its preliminary application

LIU He-yi,YU Li-yun,HOU Xi-lin,SUN Liu-xia,ZHOU Yu-long,WANG Jin-yi,LIU Shuang-yi,PIAO Fan-ze

(Animal Technology College of Heilongjiang August First Land Reclamation University,Daqing163319,China)

To obtain and analyze the sequence of the nucleocapsid gene from bovine coronavirus,and to produce the fusion protein of the N gene inE.coliin order to use this recombinant protein for the study of bovine coronavirus.The N gene of BCV-DQ strain was amplified by RT-PCR,in which the primers were designed on the basis of N gene sequence of BCV-Mebus strain.The PCR products of 1 347 bp in length were cloned and sequenced,and then inserted into the prokaryotic vector pET30a.The recombinant plasmids were then transformed intoEscherichia coliBL21 and identified by SDS-PAGE and Western blot assay.ELISA assay was optimized of N protein as the coating antigen to detect the viruses in the clinical samples.In comparison with 6 BCV strains in GenBank,the sequence identity was proved to be more than 98.3%.Result in SDS-PAGE showed that the fusion protein had a molecular weight of 60 ku,and could be specifically recognized by mouse serum against BCV.The indirect ELISA was used to test 256 serum samples collected from Heilongjiang province and 65.23%samples were positive.On testing field samples,an overall agreement of 95.31%was generated between the the neutralization test of viruses(VN)and indirect ELISA.It is apparent that the N gene was highly conservative and is expressed inE.coliin high level,also the prokaryotic expression products of this gene show a fine reactiongenicity in immune responses.It was also suggested that the N protein may be a useful antigen for sero-diagnosis and epidemiological investigation of BCV.

bovine coronavirus;N gene;cloning;sequence analysis;prokaryotic expression

S852.65

A

1002-2694(2010)01-0076-05

*黑龍江農墾總局攻關課題(HNKXIV-08-07)

侯喜林,Email:xly_hou@yahoo.com.cn

黑龍江八一農墾大學動物科技學院,大慶 163319

2009-02-18;

2009-09-09