大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表達質粒的構建及表達*

易亮衡,秦永偉,陳金鈴,朱丹丹,何興新,段義農

2.湖北省黃石市疾病預防控制中心,黃石 435000

大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表達質粒的構建及表達*

易亮衡1,2,秦永偉1,陳金鈴1,朱丹丹1,何興新1,段義農1

目的構建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表達質粒,并研究該質粒在真核細胞COS-7中的有效表達。方法以含有p55全長基因的質粒為模板,通過PCR擴增p55基因片段,克隆至pGEM-T載體中,經酶切后再將p55基因重組至真核表達載體pcDNA3.1(+)中,構建重組真核表達質粒pcDNA3.1(+)-582,經限制性內切酶酶切分析及測序鑒定正確后,應用脂質體轉染技術轉染入COS-7細胞,RT-PCR檢測其基因轉錄情況,SDS-PAGE鑒定其表達相應的目的蛋白質情況。結果成功擴增了p55基因片段,酶切和測序證明正確構建了重組真核表達質粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDSPAGE方法證實該片段能在COS-7細胞中有效表達目的蛋白質。結論成功構建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表達質粒載體,并在COS-7細胞中表達,為進一步進行核酸疫苗的研究奠定了基礎。

大鼠源肺孢子菌;p55基因;真核表達

2.湖北省黃石市疾病預防控制中心,黃石 435000

肺孢子菌(Pneumocystis)是一類重要的機會性致病真菌,廣泛存在于人和哺乳動物肺組織內,可以引起肺孢子菌肺炎(Pneumocystispneumonia,PCP)。PCP目前已成為艾滋病患者最常見的機會性感染,并是其致死的主要原因〔1〕。此外,惡性腫瘤、器官移植術后、惡性營養不良、大量的免疫抑制劑、抗腫瘤藥物的應用以及放射線照射等造成機體免疫功能低下也極易誘發本病〔2〕。PCP一旦發生,病情進展迅速,病死率極高,不經治療幾乎100%死亡,故越來越受到國內外的重視。廣泛預防服藥使抗藥性出現的比率在逐漸增高,預防用藥尚不能完全預防肺孢子菌肺炎的發生。由于缺少可靠、穩定的連續的體外培養體系,迄今體外培養技術難以提供大量肺孢子菌抗原,用肺孢子菌可溶性抗原或活肺孢子菌進行免疫在實際工作中受到限制〔3〕。因此開展重組抗原的研究將是PCP免疫預防的一個重要課題。大鼠源肺孢子菌(pneumocystisof rats)抗原p55(Mr 55 000)是Pc的主要抗原之一。早期感染Pc宿主的肺泡灌洗液中可檢測出該抗原。Smulian 等〔4〕和 Theus等〔5〕發現重組 p55 蛋白能刺激宿主產生免疫反應。基于p55抗原的研究,p55抗原可能成為PCP免疫預防的一個重要途徑。本研究采用基因克隆的方法構建Pc p55抗原基因部分片段真核表達載體,并在COS-7細胞中進行表達,為進一步開展核酸疫苗免疫特性研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物模型、菌株、細胞及載體 雌性清潔級SD大鼠(南通大學實驗動物中心),Esherichia coliDH5α菌株(上海生工生物工程有限公司);COS-7細胞株(本室保存);pGEM-T載體(Promega公司);pcDNA3.1(+)(本室保存)。

1.1.2 主要試劑 基因組DNA純化試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒、柱式質粒小量/中量抽提試劑盒(上海生工生物工程公司);XHoI、EcoRⅠ、T4連接酶、耐熱TaqDNA聚合酶(TAKARA公司);Lipotap轉染試劑盒(碧云天生物技術研究所);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司);其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 參考文獻〔6〕方法,建立大鼠源肺孢子菌肺炎動物模型。

1.2.2 基因組DNA的提取 按文獻〔7〕方法,提取大鼠源肺孢子菌基因組DNA。

1.2.3 引物設計及PCR擴增 根據已報道p55基因序列〔8〕設計一對引物,用Primer5.0分析軟件分析其可行性。引物序列:上游引物(P1):5＇CCGGAAT TCACCATGGATT TATGTTGT 3＇下游引物 (P2):5＇CCGCTCGAGTCAATGCGTATTATCTG 3＇,上海英駿生物工程技術服務有限公司合成。PCR 體系:模板 2μ g,上下游引物(20μ mol/L)各 1μ L,TaqDNA 聚合酶 0.5μ L,dNTP 4μ L,PCR Buffer 5μ L,MgCl25μ L,加 ddH2O 至 50μ L 。反應按下列條件進行:94℃3min,94℃45s,60℃45s,72℃60s,反應 30個循環,最后72℃延伸7 min,電泳檢測擴增產物。

1.2.4 pGEM-582基因克隆與鑒定 PCR產物經凝膠電泳后,回收目的條帶,與pGEM-T載體連接,轉化DH5α感受態細胞,篩選白色菌落過夜培養,質粒抽提,酶切鑒定。

1.2.5 重組表達質粒pcDNA3.1(+)-582的構建取適量pGEM-582基因和pcDNA3.1(+)質粒,分別用EcoRⅠ和X HoⅠ雙酶切。再進行連接反應:10×T4 DNA連接酶 buffer 1μ L,T4 DNA連接酶(20U/μ L)1μ L,雙酶切的 pcDNA3.1(+)1μ L,雙酶切的基因片段5μ L,共10μ L體系;并以水代替目的基因片段作為對照。連接產物轉化DH5α,篩選,小量擴增后,抽提重組表達質粒 pcDNA3.1(+)-582。

1.2.6 重組表達質粒pcDNA3.1(+)-582的鑒定用EcoRⅠ和X HoⅠ雙酶切重組表達質粒pcDNA3.1(+)-582,進行瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定并測序。

1.2.7 重組表達質粒 pcDNA3.1(+)-582轉染COS-7細胞 COS-7細胞常規培養傳代,至細胞60%～70%融合,采用脂質體轉染法,分別將pcDNA3.1(+)-582質粒和pcDNA3.1(+)空質粒轉染COS-7細胞。

1.2.8 RT-PCR法檢測mRNA表達 參照Trizol試劑盒說明書進行操作,常規抽提轉染pcDNA3.1(+)-582質粒和pcDNA3.1(+)空質粒的COS-7細胞中的總 RNA,分別取上述總RNA 2μ g,逆轉錄合成cDNA第一條鏈,再進行PCR擴增,反應條件同1.2.3。分別取少量PCR產物進行電泳檢測,判斷PCR產物大小。

1.2.9 SDS-PAGE檢測蛋白表達 用細胞裂解液裂解細胞,收集轉染重組質粒、空質粒的COS-7細胞培養液,經離心后提取上清,與加樣緩沖液混合,分別用沸水煮5 min,各取20μ L電泳,同時用細胞培養液作陰性對照。電泳結束,考馬斯亮藍染色,脫色液脫色后凝膠攝像。

2 結 果

2.1 大鼠源肺孢子菌p55基因片段PCR擴增結果應用PCR擴增大鼠源肺孢子菌p55基因得到約582 bp的條帶,與實驗預期結果相符(圖1)。

圖1 PCR擴增結果Fig.1 Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresis

2.2 重組表達質粒pcDNA3.1(+)-582的篩選、酶切及測序 從含X-gal的培養基中選擇白色菌落,抽提的質粒酶切電泳顯示兩條帶,一條為插入p55基因片段約582 bp,另一條為切開的載體質粒pcDNA3.1(+)約5.4 kb的片段(圖2)。測序結果與先前報道〔8〕一致。

圖2 重組質粒雙酶切及PCR鑒定結果Fig.2 Characterization of the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-582by restrictionenzymedigestionand PCR products

2.3 RT-PCR法檢測結果 將轉染pcDNA3.1(+)-582質粒的COS-7細胞進行RT-PCR,擴增出pcDNA3.1(+)-582特異性基因片段,產物大小與預期片段大小相符(圖3)。

圖3 RT-PCR結果Fig.3 RT-PCR analysis of pcDNA3.1(+)-582 expression

2.4 SDS-PAGE結果 將轉染pcDNA3.1(+)-582質粒的COS-7細胞裂解液進行SDS-PAGE,在分子量約21 kDa左右的區域出現一特異蛋白條帶(圖4第1道),這與 p55片段蛋白大小一致,其空質粒的細胞裂解液及未轉染細胞裂解液中無此條帶(圖4中第2、3道)。

圖4 SDS-PAGE檢測蛋白表達Fig.4 SDS-PAGE analysis of the protein expression of pcDNA3.1(+)-582

3 討 論

大鼠源肺孢子菌55kDa蛋白(p55)是菌體的主要抗原分子之一,目前,有關p55的生物學功能并不完全清楚。Smulian等〔4〕發現天然 p55蛋白能刺激宿主產生細胞免疫和體液免疫反應,重組p55蛋白主動免疫能夠產生部分免疫保護作用,因此p55抗原在宿主的免疫防御上起著重要的作用。Zheng等研究發現p55作為非CD4+T細胞依賴的疫苗能防止小鼠感染 Pc,認為是最有希望的候選疫苗〔9〕。Ma等研究認為p55抗原重復序列至少存在一個抗原表位〔10〕。p55抗原分子能引發宿主產生較強的細胞免疫應答及體液免疫應答〔8〕。其原因是p55在主動免疫后,其 5＇端 p55(1-200)具有免疫原性,進而引起細胞免疫及體液免疫〔5〕。

由脂質體介導的轉染是將DNA導入細胞且重復性較好的方法之一。其原理是帶陽性電荷的脂質體與帶陰性電荷的DNA之間可以有效地形成復合物,此復合物通過內吞作用可進入細胞中。存在于細胞質中的DNA-脂質體復合物仍然保持著完好的結構,并有機會以同樣的方式與細胞核膜發生相互作用,并進入核內,從而啟動外源基因轉錄表達。利用這種方法將重組質粒轉染COS-7細胞后,將培養48 h的細胞收集起來用PBS緩沖液清洗3次后,一部分提取細胞總RNA,用克隆片段的上下游引物進行特異性RT-PCR擴增,結果轉染了重組質粒的COS-7細胞RT-PCR產物陽性,而對照組結果陰性,表明確實有p55基因片段的RNA轉錄體產生,即表明p55基因的片段能夠表達;一部分進行SDSPAGE分析,結果顯示細胞裂解液中有p55基因片段蛋白的產生,而空質粒的細胞裂解液及細胞培養液中無相應蛋白產生。

真核表達的質粒DNA可在多種組織細胞表達外源蛋白質。本研究所用細胞系為COS細胞系,COS細胞系是進行外源性DNA真核表達最常用的宿主細胞之一,對SV40系列載體轉染具較高敏感性。在常規轉染實驗中,每個COS細胞可積聚大于105個帶SV40復制起點的重組表達質粒,且能高效表達重組表達質粒所攜帶的外源DNA片段。所采用的真核表達載體pcDNA3.1(+)含有一定數量的CpG寡核苷酸序列。這種在原核生物基因組中以一定頻率存在的未甲基化CpG二核苷酸,能夠在動物體內通過一系列連鎖反應,而激活機體的免疫系統,放大抗原的免疫效應,而具有免疫佐劑的功能。導入個體的疫苗DNA被B細胞、巨噬細胞等抗原提呈細胞內吞后,質粒中的CpG寡核苷酸序列可被宿主細胞識別,并激活核因子NF-κ B(NFkappaB),從而誘導IL-6、IL-12和干擾素等細胞因子分泌,進而產生一定的免疫應答。

本研究成功構建重組表達質粒 pcDNA3.1(+)-582。采用了脂質體包裹瞬時轉染細胞的方法轉染COS-7細胞,結果表明pcDNA3.1(+)-582重組質粒能成功轉染體外培養的 COS-7細胞并在mRNA水平及蛋白水平上均檢測到有效表達。為進一步深入進行大鼠源肺孢子菌p55抗原基因片段核酸疫苗的免疫特性研究奠定了基礎。

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Construction and expression of the eukaryotic expression vector containing the p55 gene fragment of ratPneumocystis

YI Liang-heng,QIN Yong-wei,CHEN Jin-ling,ZHU Dan-dan,HE Xing-xin,DUAN Yi-nong

(Department of Parasitology,School of Medicine,Nantong University,Nantong226001,China)

To construct the eukaryotic expression plasmid containing the p55 gene fragment ofPneumocystisand to investigate the efficient expression in COS-7 cells,the gene fragment conaining the whole length of p55 gene was used as template to amplify this fragment with PCR and the amplified fragment was then cloned to vector pGEM-T.After enzyme digestion,p55 gene was cloned to the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)to construct the plasmid pcDNA3.1(+)-582.This plasmid was then transfected to the eukaryotic expression cells COS-7 and PCR and SDS-PAGE assays were used to confirm the presence of target protein in these cells.In these ways,the eukaryotic expression vector for the p55 gene ofPneumocystisof rats was successfully constructed and expressed in COS-7 cells,thus providing the basis for further studies on the nucleic acid vaccine.

Pneumocystisof rats;p55 gene fragment;eukaryotic expression

R382.9

A

1002-2694(2010)01-0025-04

*南通大學自然科學基金資助項目(No.08Z044)

段義農,Email:ynduan@126.com

1.南通大學醫學院寄生蟲學教研室,南通 226001;

2009-07-13;

2009-10-11