格林巴利綜合征相關及單純腹瀉相關空腸彎曲菌細胞毒作用分析*

孟凡亮,張茂俊,何利華,張建中

格林巴利綜合征相關及單純腹瀉相關空腸彎曲菌細胞毒作用分析*

孟凡亮,張茂俊,何利華,張建中

目的分析格林-巴利綜合征(GBS)相關空腸彎曲菌細胞毒素(CDT)作用。方法9株GBS相關空腸彎曲菌以及4株腹瀉患者分離菌株的全菌蛋白分別以0.001 μ g～ 5μ g/mL的濃度作用于HeLa細胞,通過觀察細胞形態的改變,獲得不同菌株對細胞作用的差異。結果不同菌株間產生細胞毒作用的濃度范圍從0.01μ g/mL到5μ g/mL。結論GBS相關菌株對HeLa細胞的細胞毒素作用與腹瀉患者分離株相比沒有顯著差異。不同空腸彎曲菌菌株對HeLa細胞的細胞毒素作用具有菌株特異性。

空腸彎曲菌;細胞毒素;HeLa細胞

空腸彎曲菌(Campy lobacter jejuni,C.jejuni)是主要導致人類腹瀉的彎曲菌屬的一個種〔1〕。空腸彎曲菌感染導致的人類疾病稱為空腸彎曲菌病,世界衛生組織(WHO)將空腸彎曲菌病列為27種新發傳染病之一。空腸彎曲菌病的主要癥狀是腹瀉性腸炎。除腸炎外,空腸彎曲菌的感染與GBS密切相關,是導致GBS的主要病因之一〔2〕,感染了GBS相關的空腸彎曲菌,疾病負擔增加。細菌的細胞毒性作用與細菌的致病力密切相關,研究發現空腸彎曲菌菌株的細胞毒素作用與菌株感染后導致的臨床結果有關,細胞毒素作用強的菌株導致的臨床癥狀明顯嚴重〔3-4〕。為進一步了解空腸彎曲菌尤其是GBS相關的空腸彎曲菌的細胞毒素作用特征,本研究利用細菌細胞相互作用模式,對9株背景資料清晰的格林-巴利綜合征相關空腸彎曲菌菌株以及4株腹瀉相關菌株作用于Hela細胞,通過Hela細胞的形態變化特點,初步分析了13株空腸彎曲菌對細胞的相關毒素作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細菌:本科室保存的13株空腸彎曲菌(9株從GBS病人分離,4株從腹瀉病人分離,菌株的背景及相關生物特征見表1)。以菌株81-176作為陽性對照、幽門螺桿菌J99為陰性對照。細胞:HeLa細胞,由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所腹瀉病研究室贈。空腸彎曲菌培養液:細菌培養基為哥倫比亞瓊脂(OXOID M0331),細胞培養基為RPMI1640培養基(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、Trypsin-EDTA(GIBCO)。

表1 空腸彎曲菌菌株背景及對HeLa細胞的最小作用濃度Table 1 Background of C.jejuni strains and minimum concentration on HeLa cells

1.2 方法

1.2.1 細菌培養 復活保存的空腸彎曲菌,取單菌落菌株轉種于含10%羊血的哥倫比亞瓊脂,微需氧條件(5%O2,10%CO2,85%N2)37℃培養24h。

1.2.2 全菌裂解液收集 收集細菌,用PBS(pH 7.4)洗2遍(4 000g離心,4℃,5min),將沉淀菌體重懸于2 mL PBS中超聲破碎(4s×10),12 000 r/min離心 10min,上清用0.22μ m 除菌過濾。BCA法檢測蛋白濃度后分裝,-80℃保存備用。

1.2.3 HeLa細胞的培養 復蘇HeLa細胞,用10%FBS-1640培養基,置于二氧化碳孵箱,37℃培養2～3d后,用Trypsin-EDTA消化后轉到24孔細胞培養板,2×104cells/孔,培養24 h,細胞毒素作用前2h換為1.5%FBS-1640培養基。

1.2.4 全菌蛋白細胞毒性檢測 分別將5μ g/mL、1μ g/mL 、0.1μ g/mL 、0.01μ g/mL 和 0.001μ g/mL不同濃度的細菌全菌蛋白裂解液與HeLa細胞共同培養,連續觀察細胞形態改變(細胞發生腫脹,變大,形狀變得不規則,最后破裂)。當50%以上的細胞形態發生改變時,確定為該菌蛋白的最小作用濃度。比較不同菌株最低作用濃度的差異(μ g/mL),PBS作為空白對照。

2 結 果

空腸彎曲菌全菌蛋白作用于HeLa細胞后,細胞發生腫脹、變大、形狀變得不規則、最后破裂(圖1)。不同濃度的細菌裂解液作用于HeLa細胞,細胞形態變化不同,相同菌株隨著蛋白濃度的增加,細胞變化強度增加。不同菌株作用于HeLa細胞后導致細胞形態發生變化的的最小作用濃度(50%以上細胞形態發生改變)不同(表1)。實驗結果顯示CJGBLC株空腸彎曲菌細胞毒性較弱,濃度為5 μ g/mL時,對HeLa細胞未產生明顯的細胞毒性作用(圖1-D);陽性對照株81-176在濃度為0.01 μ g/mL時仍對HeLa細胞產生細胞毒性作用(圖1-C);陰性對照幽門螺桿菌 J99在濃度為 5 μ g/mL時對HeLa細胞無明顯細胞毒性作用。

3 討 論

圖1 空腸彎曲菌全菌蛋白作用于HeLa細胞后,細胞形態變化(圖片用Olympus BX51顯微鏡拍攝,100×)Fig.1 Morphologic change of HeLa celles after treated with whole cell lysis of C.jejuni strains

西方發達國家中,空腸彎曲菌的感染位于食源性感染的首位,是主要的食品安全監測病原。我國自上世紀80年代第一次分離出空腸彎曲菌后,全國各地都有關于空腸彎曲菌的報導。隨著我國經濟的發展和國民生活模式的改變,我國空腸彎曲菌的感染也越來越受到國家疾病預防控制工作的重視。空腸彎曲菌感染后導致的臨床癥狀是腹瀉性腸炎,同時患者伴有發熱,頭疼,腹痛,惡心,嘔吐等癥狀。空腸彎曲菌腸炎分為輕、中、重型。空腸彎曲菌的致病機制不是很清楚,但菌株的脂多糖成分,菌株的黏附定植能力以及菌株的活動力等皆與菌株的致病機制相關。目前研究發現空腸彎曲菌感染后導致的臨床表現與菌株的細胞毒性有關。細胞溶漲毒素CDT(cytolethal distending toxin,簡稱 CDT)〔5-6〕是目前研究證明空腸彎曲菌的唯一細胞毒素,本次研究應用CDT基因皆為陽性,血清型不同的,來源于GBS患者的9株空腸彎曲菌和來源于腹瀉病患者的4株空腸彎曲菌,比較了其對HeLa細胞的細胞毒素作用。結果發現,不同菌株細胞毒作用的最低作用濃度有顯著差異。菌株81-176的細胞毒作用最強,最小作用濃度為0.01 μ g/mL。13株空腸彎曲菌中,10株的最小作用濃度相同,皆為 0.1 μ g/mL。其中菌株CJ-GBLC的最小作用濃度最高,是其它菌株的50倍多,表明其細胞毒素作用遠遠小于其它菌株。與對照陽性菌株81-176相比,空腸彎曲菌菌株間細胞毒性作用可以相差500倍。

本次研究結果表明,空腸彎曲菌的細胞毒作用與菌株的血清型沒有顯著的相關性。GBS相關菌株與普通腹瀉相關菌株比,其細胞毒素作用沒有顯著差異。即使菌株CDT基因陽性,空腸彎曲菌不同菌株的細胞毒作用可以相差較大。是不同菌株CDT的含量或毒性差異,還是除CDT外,空腸彎曲菌存在其它細胞毒素決定因子,有待進一步分析。

〔1〕M oore JE,Corcoran D,Dooley JS,et al.Campylobacter〔J〕.Vet Res,2005,36(3):351-382.

〔2〕張茂俊,張建中.空腸彎曲菌病與格林巴利綜合征〔J〕.中華流行病學雜志,2008,29(6):618-621.

〔3〕Bang D D,Schuetsz F,Ahrens P,et al.Prevalence of cytolethal distending toxin(CDT)genes and CDT production in Campylobacter SPP isolated from Danish broilers〔J〕.Journal of medical microbiology,2001,50(12):1087-1094.

〔4〕Yamano R,Ohara M.Prevalence of cytolethal distending toxin production in periodontopathogenic Bacteria〔J〕.Journal of Clinical Microbiology,2003,41(4):1391-1398.

〔5〕Coote J G,Stewart-tull D E,Owen R J,et al.Comparison of virulence-associated in vitro properties of typed strains of campylobacter jejuni from different sources〔J〕.J Med Microbile,2007,56:722-732.

〔6〕謝龍山,蔡方成.Penner 19空腸彎曲菌毒素的細胞毒性作用研究〔J〕.中華兒科雜志,2002,40(5):283-287.

Cytotoxic effect of Guillain-Barre syndrome-associated and diarrhea-associatedCampylobacter jejuni

MENG Fan-liang,ZHANG Mao-jun,HE Li-hua,ZHANG Jian-zhong

(National Institute of Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing102206,China)

In order to assess the cytotoxin effect ofCampylobacter jejuni(C.jejuni),the whole cell lysates from 9 strains of Guillan-Barre Syndrome(GBS)-associatedC.jejuniand 4 strains of diarrhea-associatedC.jejuniwere co-cultivated with HeLa cells at the concentration of 0.001-5.00μ g/mLin vitro.The morphologic change of HeLa cells was observed under Olympus BX51 microscope after treatment with different concentration of bacteria lysate in the following 4 days.The morphological changes including swelling,irregularity and lysis of the affected cells over 50%was selected as the cut off for positive change andC.jejuni81-176 andHelicobacterJ99 strains were chosen as the positive and negative control.It was found that the minimum concentration to induce the positive changes in 10 strains(8 GBS associated and 2 strains from diarrhea patients)was 0.1μ g/mL and 1 strain with the positive change at the minimum concentration of 1 μ g/mL.There was only one GBS-associated strain causing no morphologic change on HeLa cells at the concentration of 5μ g/mL.It was evident that the cytotoxic effect ofC.jejunistrains on HeLa cell was strain-specific,and there was no significant difference in the cytotoxic effect on HeLa cell between GBS-associated and diarrhea associatedC.jejunistrains.

Campylobacter jejuni;cytotoxic effect;HeLa cell

R331

A

1002-2694(2010)01-0010-03

*十一五國家科技支撐計劃課題(2006BAK02A15-2)

張建中,Email:zhangjianzhong@icdc.cn

中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所,北京102206

2009-06-11;

2009-10-09