編碼日本血吸蟲Argonaute蛋白全長cDNA克隆、表達及初步鑒定*

楊燕萍,郭素霞,陳 晶,林矯矯,劉宗平,程國鋒

2.揚州大學獸醫學院,揚州 225009

編碼日本血吸蟲Argonaute蛋白全長cDNA克隆、表達及初步鑒定*

楊燕萍1,2,郭素霞1,陳 晶1,林矯矯1,劉宗平2,程國鋒1

目的獲得編碼日本血吸蟲Argonaute基因的全長cDNA,并進行克隆和重組融合蛋白表達。方法 利用RACE技術獲得編碼日本血吸蟲Argonaute基因的全長cDNA并對其進行生物信息學分析。利用實時熒光定量PCR(Real time PCR)分析該基因在日本血吸蟲中的轉錄情況。原核表達保守功能域蛋白和全長蛋白,利用保守功能域重組融合蛋白免疫昆明系小鼠制備多克隆抗體。免疫印跡(Western blot)進行免疫學分析。結果 本研究獲得了一個編碼日本血吸蟲Argonaute基因的全長cDNA,其完整開放閱讀框為3 030 bp,編碼1 009個氨基酸,預測分子量為111.7 kDa。生物信息學分析表明該基因編碼的蛋白序列具有Argonaute家族蛋白的典型結構域特征,且與人、鼠Argonaute蛋白具有較高的同源性。Realtime PCR分析表明該基因在7,14日齡的日本血吸蟲童蟲中轉錄較高。Western blot分析制備的多抗具有較高的特異性并能識別全長融合蛋白。結論 獲得了編碼日本血吸蟲Argonaute基因的cDNA及重組蛋白,為進一步研究該蛋白的功能奠定了基礎。

日本血吸蟲;Argonaute蛋白;RACE;功能分析

在最近十幾年中,研究表明非編碼小RNA,諸如小干擾 RNA(small interference RNA,siRNA),微小 RNA(microRNA,miRNA)和 PIWI相關RNA(PIWI interacting RNA,piRNA)等在生物體的生長發育中發揮重要的調控作用〔1〕,Argonaute通過與小分子RNA選擇性結合在此調控進程中扮演重要角色。

Argonaute蛋白首先在植物中發現,隨后在酵母、線蟲、小鼠和人等諸多物種發現此類蛋白分子,它們通常含有 PAZ(PIWI-Argonaute-Zwille)和PIWI兩個功能域,因此,將Argonaute蛋白分成PAZ和PIWI兩個亞家族。但在不同物種中含有數目不同的編碼基因,如在酵母中含有1個Argonaute蛋白基因,而在線蟲中含有27個,在小鼠和人中含有 8 個〔2〕。

目前,在日本血吸蟲的研究中尚無有關Argonaute蛋白的研究報道,但利用體外合成的小干擾RNA分子可成功實現血吸蟲蟲體內基因的敲降〔3〕,血吸蟲不同發育時期表達一系列微小RNA分子提示Argonaute蛋白在血吸蟲的生長發育中發揮重要的作用〔4-5〕。鑒于此,本研究利用 RACE技術研究日本血吸蟲Argonaute蛋白的編碼cDNA序列,分析了該基因在日本血吸蟲不同發育階段蟲體中的轉錄情況,并利用大腸桿菌對Argonaute蛋白進行了重組融合表達,本研究為進一步探討Argonaute蛋白在血吸蟲生長發育中的功能并以此為切入點開發新的抗血吸蟲藥物靶標和疫苗分子奠定了初步基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和酶 Trizol購自Invitrogen公司;5'-FullRACE Kit,pMD19-T Vector,Prime-ScriptTMRT reagent Kit,SYBR○RPremix Ex TaqTM(Perfect Real Time),限制性內切酶購自大連寶生物工程有限公司;Spin Column DNA Gel Extraction Kit購自生物工程(上海)有限公司;BBST NTA Resin上海博彩生物科技有限公司;RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司;羊抗小鼠IgG-HRP購自上海鼎國生物技術有限公司;HRPDAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司。1.2 菌種和實驗動物 大腸桿菌DH5α購自生物工程(上海)有限公司;大腸桿菌BL21購自天根生化科技有限公司;新西蘭白兔(雄性,2.5～3.0 kg)購自上海羅涇飛達實驗動物養殖場;昆明系小鼠購自上海斯萊克實驗動物中心;日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農業科學院上海獸醫研究所釘螺室提供;新西蘭白兔分別以腹部貼片法感染5000-20000條血吸蟲尾蚴,在感染后第 7、14、22、32和42 d剖殺,以肝門靜脈灌注法收集蟲體〔6〕,液氮凍存備用。收集42 d感染兔的肝臟并純化蟲卵,液氮凍存備用。

1.3 總RNA的提取和5'RACE的擴增 取液氮中凍存的日本血吸蟲蟲體,按T rizol試劑盒說明書提取14d童蟲總RNA。以人和鼠的Argonaute蛋白氨基酸序列查詢GenBank中日本血吸蟲數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)獲得其中1個日本血吸蟲EST片段(GenBank登錄號AY809756.1),長 701 bp,不含完整的ORF,但含有3'非編碼區。以該 EST序列為模板設計合成5′RACE引物(由Invitrogen公司合成)。5GSP1:5′-GAC TAG GTC GAG AAG TGC CTT GAA TAC CA-3′;5GSP2:5′-ACG CAT GCT TCA CGT ATT GCA CGG AGT TC-3′;5GSP3:5′-CGA GCA GGT GGC TCA AAC TGT ATA AGG TG-3′;5GSP4:5′-CAA CTT GGT CCG CTG GTC CGT TAC CAA TC-3′,具體步驟按5'-Full RACE Kit操作手冊進行。將RACE產物克隆到pMD19-T Vector中,挑選陽性克隆,由上海桑尼生物技術有限公司測序。將測序結果與已知序列拼接得到完整序列。

1.4 生物信息學分析 利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)Blast和ORF finder進行同源性分析和編碼框的預測;利用DNAStar軟件對氨基酸殘基數、組成、蛋白質相對分子質量等參數進行分析;根據蛋白質數據庫登錄的果蠅、小鼠、人及曼氏血吸蟲的Ago家族蛋白,包括Dm.Ago1(NP_725342.1),Dm.Ago2(ABB54719.1),Dm.Ago3(ABO26294),Ce.ALG1(NP_510322.2),Ce.ALG2(NP_493837.1),Hs.AGO1(Q9UL18),Hs.AGO2(Q9UKV8),Hs.AGO3(Q9H9G7.2),Hs.AGO4(Q9HCK5),Mm.AGO2(Q8CJG0),Mm.AGO1(Q8CJG1),Mm.AGO3(Q8CJF9),Mm.AGO4(Q8CJF8),Sm.Ago1(Smp_140010),Sm.Ago2(Smp_179320),Ago3(Smp_102690.2),Sm.Ago4(Smp_102690.3),利用ClustalX軟件對不同物種的Argonaute蛋白氨基酸序列進行多重比對并進一步利用MEGA4軟件構建系統進化樹。

1.6 實時熒光定量RT-PCR檢測 分別提取日本血吸蟲蟲卵 、7、14 、22、32 d 及 42 d 蟲體總 RNA,定量,用PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄獲得日本血吸蟲cDNA。以日本血吸蟲核糖體RNA18s為內參,以不同期別的日本血吸蟲cDNA為模板,用SYBR○RGreen I嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR分析。Argonaute引物:Sense:5'-TGTGTAATGTGACACGACGA-3', Anti-sense:5'-GCTT TTGCTCTTGACCAAC-3',預期擴增片段長度 165bp。18s引物:Sense:5'-GCAAACTGTT TCATCACCG-3',Anti-sense:5'-CAATCCAACGACCTCACTAA-3',預期擴增片段長度172bp,上述引物均由Invitrogen公司合成。反應體系為 10μ l,包括:5μ L 2×SYBR○RPremix Ex T aqTM,0.2μ L 10μ mol/L 上游引物 ,0.2μ L 10μ mol/L 下游引物,4.1μ L ddH2O,0.5μ L cDNA 模版。反應參數為95℃預變性15s,然后以45個循環進行PCR擴增(95℃5 s,54℃15 s,72℃20 s),每個反應均做3孔重復。

1.7 Argonaute蛋白保守功能域的原核表達及抗體制備 根據生物信息學分析結果,選取PIWI保守功能域設計引物,sense:5'-CTC GAATTCTCTTGGTGCAGATGTTAC-3'(2306-2323bp),antisense:5'-GCGAAGCT TATGCGT TTAAAATTATGC 3-(3102-3119bp)并在上下游引物分別引入HindⅢ、EcoRⅠ酶切位點序列,利用14d cDNA為模板進行PCR擴增,利用Spin Column DNA Gel Extraction Kit回收擴增產物并對PCR產物進行酶切處理,將酶切處理的PCR純化產物連接到經相同酶切處理的表達載體pET28b(+)上,構建重組質粒pET28b(+)-ago,并轉化到大腸桿菌Bl21中培養。挑取陽性克隆分別進行PCR、酶切鑒定和測序驗證。將驗證為正確的單克隆轉至500mL LB培養基中37℃培養,以200r/min搖瓶培養誘導6h。離心收集菌體,超聲裂解菌體蛋白,通過Ni柱純化蛋白,純化產物用SDS-PAGE電泳檢測分析〔7〕。

將純化后蛋白免疫昆明系小鼠制備多克隆抗體。具體為,應用206佐劑乳化純化蛋白,免疫劑量為50μ g/只/次,每隔14 d背部皮下多點強化免疫1次,共4次,在第8周收集動物血清,-20℃保存備用。

1.8 Argonaute全長融合蛋白的原核表達、純化和抗體驗證分析 根據全長序列中ORF設計引物Sense:5'-CCGGAAT TCATGCTGAATATGTATGGAACTATT-3'(78-101bp),Anti-sense:5'-CCCGCTCGAGTGAATGGAGGT TGACTGGTG-3'(3185-3204bp),14 d血吸蟲cDNA為模板進行PCR擴增,用 Spin Column DNA Gel Extraction Kit回收PCR產物,利用PCR產物兩端的EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點進行雙酶切,純化產物連接到經相同雙酶切處理的表達載體pET32a(+)上,構建重組質粒pET32a(+)-ago,并轉化到大腸桿菌BL21中培養。挑取單個菌落分別以PCR、酶切鑒定和測序進行驗證。取驗證為陽性的單克隆轉至500mL LB培養基中20℃,200r/min誘導2h。離心所取培養物,收集菌體,超聲裂解收集蛋白,通過Ni柱純化蛋白。應用本研究中制備的多克隆抗體,利用Western blot驗證重組融合蛋白。具體為,以RIPA裂解液收集14 d童蟲總蛋白,進行SDS-PAGE電泳,然后經 280 mA恒流轉膜 2h。用封閉液(PBST配制的5%(m/v)脫脂奶粉)4℃封閉過夜,以PBST洗膜后,依次滴加1∶200的抗血清(37℃孵育2h,洗膜3次,每次10 min)及1∶2 000的H RP標記的羊抗小鼠IgG(37℃孵育 2h,洗膜3次,每次10 min),用HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色后檢測目的蛋白。

2 結果與分析

2.1 編碼Argonaute蛋白的全長cDNA及生物信息學分析 5'-RACE獲得2 510bp產物,生物信息學進一步分析表明日本血吸蟲Argonaute全長編碼cDNA為3 211 bp,包含3 030 bp的開放閱讀框,編碼1 009個氨基酸,預測分子量為111.7 kDa。利用Smart軟件分析表明此開放閱讀框包含PAZ和PIWI功能域。序列多重比較分析表明該基因所編碼氨基酸序列與曼氏血吸蟲的AGO1具有較高的同源性,達93%,與人AGO1的同源性為 71%,與果蠅AGO1為69%,秀麗線蟲為61%。系統進化樹分析表明本研究獲得的日本血吸蟲Argonaute與人和鼠更接近(圖1)。

2.2 Argonaute基因的發育時期的轉錄分析 為了解Argonaute基因在日本血吸蟲不同發育時期的表達情況 ,分別提取蟲卵 、7d 、14d、22d、32d、42d 蟲體的總RNA,以18s作為內參,利用實時熒光定量PCR法檢測該基因在上述發育時期的轉錄情況。結果表明Argonaute在上述幾個發育時期均轉錄,但在7、14d的童蟲中轉錄較高(表1)。

表1 日本血吸蟲Argonaute基因期別轉錄分析Table 1 The transcript profiles of Argonaute in differential development stages of Schistosoma japonicum

圖1 日本血吸蟲Argonaute蛋白進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of Argonaute proteins

2.3 Argonaute蛋白的保守功能域的原核表達和抗體制備 重組克隆菌經誘導表達,SDS-PAGE分析表明在分子量35kDa處有一條帶,與融合蛋白的預期分子量一致(圖2)。利用Ni-NTA蛋白純化樹脂獲得了較高純度重組蛋白(圖3)。將重組融合蛋白免疫小鼠獲得了多克隆抗體。應用此抗體,利用Western blot檢測血吸蟲全蟲蛋白,觀察到在約分子量為110kDa左右有明顯條帶(圖4),提示本研究中制備的多克隆抗體具有較高的特異性。

圖2 SDS-PAGE分析BL21/pET28b(+)-ago重組蛋白表達Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression products of BL21/pET28b(+)-ago in E.coli

2.3 Argonaute全長蛋白的重組表達、純化和驗證分析 將含有Argonaute全長開放閱讀框的重組質粒轉移到大腸桿菌BL21中進行誘導表達,SDSPAGE分析表明在分子量約120kDa處有一特異性條帶,與Argonaute重組融合蛋白的預期分子量一致(圖5)。而且,應用本研究制備的抗體,Western blot分析表明該條帶可特異性與抗日本血吸蟲PIWI抗體反應(圖6)。總之,上述結果說明本研究獲得了日本血吸蟲Argonaute蛋白全長重組蛋白。

圖6 BL21/pET32a(+)-ago重組蛋白的Western Blot分析Fig.6 Western Blot analysis of BL21/pET32a(+)-ago recombinant protein

3 討 論

血吸蟲生活史復雜,有性生殖和無性繁殖交替,中間宿主和終末宿主轉換,血吸蟲基因的精確表達和精準調控是完成復雜生活史的前提。最近十多年中,研究表明非編碼RNA在生命體的生長發育中發揮重要的調控作用,而Argonaute蛋白則是參與此進程的關鍵分子。

本研究根據小鼠和人的Argonaute蛋白序列查詢血吸蟲的表達序列標簽數據庫,利用5'RACE技術擴增其中一個表達序列標簽,生物信息學分析表明獲得了一個編碼日本血吸蟲Argonaute蛋白的全長cDNA序列,保守功能域分析表明含有PAZ和PIWI結構域,為Argonaute蛋白典型的結構域特征。曼氏血吸蟲的基因組研究表明含有4種Argonaute家族蛋白〔8〕,多重序列比較分析表明本研究中獲得日本血吸蟲Argonaute蛋白與曼氏血吸蟲Argonaute具有較高的同源性。

以18S核糖體RNA為內參,Argonaute蛋白的不同發育時期的轉錄分析表明此蛋白在7,14 d的日本血吸蟲童蟲中轉錄較高,而蟲卵與成蟲期則較少,推測此蛋白可能通過結合非編碼RNA,協同參與血吸蟲童蟲生長發育的調控。

總之,本研究通過5'RACE技術并結合生物信息學研究獲得了一個日本血吸蟲編碼Argonaute蛋白的全長cDNA,并對其編碼蛋白進行了原核表達。利用表達重組融合蛋白,本研究獲得了特異性較強的抗體,為深入研究Argonaute蛋白在血吸蟲生長發育中的功能奠定了初步基礎。

〔1〕Stefani G,Slack FJ.Small non-coding RNAs in animal development〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9(3):219-230.

〔2〕Hock J,Meister G.The Argonaute protein family〔J〕.Genome Biol,2008,9(2):210.

〔3〕Cheng G,Fu Z,Lin J,et al.In vitroand in vivo evaluation of small interference RNA-mediated gy naecophoral canal protein silencing inSchistosoma japonicum〔J〕.J Gene Med,2009,11(5):412-421.

〔4〕Huang J,Hao P,Chen H,et al.Genome-wide identification ofSchistosoma japonicummicroRNAs using a deep-sequencing approach〔J〕.PLoS One,2009,4(12):e8206.

〔5〕Copeland CS,Marz M,Rose D,et al.Homology-based annotation of non-coding RNAs in the genomes ofSchistosoma mansoniandSchistosomajaponicum〔J〕.BMC Genomics,2009,10:464.

〔6〕李朝品,秦志輝.毛畢吸蟲成蟲分離方法的研究初報〔J〕.中國人獸共患病雜志,1999,15(4):73-75.

〔7〕薩姆布魯克 J,弗里奇 EF,曼尼阿蒂斯 T.分子克隆實驗指南〔M〕.2版.科學出版社,1993:880-887.

〔8〕Gomes MS,Cabral FJ,Jannotti-Passos LK,et al.Preliminary analy sis of miRNA pathway inSchistosoma mansoni〔J〕.Parasitol Int,2009,58(1):61-68.

Cloning,expressing and identifying of a full-length cDNA encoding Argonaute fromSchistosoma japonicum

YANG Yan-ping,GUO Su-xia,CHEN Jing,LIN Jiao-jiao,LIU Zong-ping,CHENG Guo-feng
(Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture,
Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shanghai200241,China)

The present study was intended to obtain the full-length cDNA encoding Argonaute protein(SjAGO)inSchistosoma japonicumand subsequently express the recombinant protein inE.coliBL21.A cDNA fragment encoding Argonaute was harvested as applying the RNA template isolated from 14 day schistosomula by using 5'RACE technique.Upon bioinformatical extension,a full-length cDNA encoding Argonaute protein fromSchistosoma japonicumwas obtained including a complete Open Reading Frame.The Argonaute protein has 1009 amino acids with 111.7kDa molecular weight predicted.Bioinformatical analysis indicated that theSjAGO contains PAZ and PIWI domain,which is a typical character for Argonaute protein family in other organism such as mice and human.The transcript profile ofSjAGOfrom egg,7,14,22,32 and 42d schistosomes was determined by real-time PCR and showed that the transcript ofSjAGOwas predominantly observed at schistosomula stage.The cDNA fragment encoding PIWI domain was further cloned into a pET28b(+)vector and the recombinant plasmid was transfected intoE.coliBL21cell.The recombinant protein was purified by NTA column.Kunming mice were immunized with the purified protein to raise polyclonal antibodies.The full-length cDNA encodingSjAGOwas also cloned into a pET32a(+)vector to express the recombinant protein.The full-lengthSjAGO expressed inE.coliBL21 was successfully validated when applying the polyclonal antibodies by using Western blot.In conclusion,a full-length cDNA encoding Argonaute protein fromSchistosoma japonicumwas cloned and some preliminary studies were also carried out.Results presented here provide foundational information for further investigation on Argonaute's roles in schistosome development.

Schistosomajaponicum;Argonaute;RACE;clone

R383.2

A

1002-2694(2010)09-0830-05

*國家自然科學基金(30901068),上海市科學技術委員會項目(10410703400),上海市人才發展基金(2009032)和中央級公益性科研院所基本科研業務費項目(2008JB18和2009JB08)

程國鋒,Email:chenggfeng@shvri.ac.cn

1.中國農業科學院上海獸醫研究所,農業部動物寄生蟲學重點開放實驗室,上海 200241;

2.揚州大學獸醫學院,揚州 225009

2010-03-20;

2010-05-15