口蹄疫核酸疫苗研究進展*

王 剛,潘 麗,張永光

口蹄疫核酸疫苗研究進展*

王 剛,潘 麗,張永光

口蹄疫(Foot-and-mouth-disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth-disease virus,FMDV)引起的危害嚴重的家畜傳染病之一。由于傳統疫苗的安全性、免疫保護期短、多次免疫、血清型間無交叉保護效應,感染與免疫難以區分等缺點。因而,尋求新的疫苗顯得很有必要,而蛋白、多肽、弱毒苗、核酸疫苗、可飼疫苗等都被廣泛研究。其中,核酸疫苗有許多優點,如生產工藝簡單、可以長期保存、可以表達多種抗原基因、用于標記疫苗?？谔阋吆怂嵋呙绫淮罅垦芯?并取得了不同程度的成功。

1 口蹄疫核酸疫苗的抗原形式

口蹄疫核酸疫苗一般在質粒載體中連入VP1基因、P12A3C基因、B細胞表位和T細胞表位。有大量文獻報到,以雞痘病毒〔1〕、痘病毒〔2〕、牛痘〔3〕、腺病毒〔4-5〕、質?！?〕為載體共表達 P12A 和 3C,相對與P1、VP1,可以通過表達非結構蛋白3C,加工結構蛋白P1形成病毒空衣殼,因而其免疫原性優于P1、VP1、細胞表位。有研究表明,空衣殼可以引起相對強的免疫反應,但是也有不足,如L蛋白干擾5'帽子依賴細胞內mRNA翻譯,3C阻止細胞內mRNA轉錄。Qingxia Yao等比較了P12A3C和細胞表位的免疫原性,結果表明以質粒的形式免疫豚鼠能引起相同的細胞免疫反應,但P12A3C能引起更高的體液免疫反應〔7〕。

非結構蛋白的作用機理的闡明,也為口蹄疫核酸疫苗抗原的研究提供了新的思路。非結構蛋白2B加入編碼口蹄疫空衣殼蛋白的腺病毒載體(Ad5-CI-A24-2B),能引起相對Ad5-CI-A24更強的免疫反應和更高的保護率,這可能由于2B可以引起細胞膜重排和導致細胞死亡而使抗原蛋白釋放。以編碼2C蛋白或其片段的質粒免疫小鼠,確定其存在CTL表位,但由2C引起的CT L反應沒有保護小鼠對病毒的攻擊,因為免疫沒有改變病毒血癥和致死率〔8〕。以編碼口蹄疫抗原P12A3C和 P12A3C3D的腺病毒免疫豚鼠,前者可以完全保護口蹄疫病毒攻擊,而后者只有局部保護,這可能由于更長的開放閱讀框導致蛋白表達量的減少〔9〕。有研究發現,結構蛋白更傾向于引起體液免疫反應,而非結構蛋白能夠更有效的引起細胞免疫反應〔10〕?？谔阋哳A防的細胞免疫反應的作用被逐漸認可,因而非結構蛋白的研究是很有必要的。

在郭慧琛等人的研究中,利用核糖體進入位點(IRES,internal ribosomal entry sites)來表達多順反子,共表達了 P12X3C 和 IFN-α(pcDNA/PIF),其中2X包括部分2B和3B序列,結果表明pcDNA/PIF和共免疫pcDNA/P12X3C和pcDNA/IFN在特異性抗體、中和抗體、T細胞免疫水平上沒有顯著差異,因而雙順反子載體比兩個質粒共免疫更方便〔11〕。也有報到以腺病毒為載體,借助IRES共表達了兩個血清型的P12A基因和3C基因,并能夠引起中和抗體〔5〕。編碼口蹄疫VP1蛋白和豬細胞因子IFNα的多順反子 rAd-pIFNα-VP1相對單順反子(rAd-VP1+rAd-pIFNα)共免疫小鼠能顯著增加細胞免疫和體液免疫反應〔12〕。

在細胞表位上連上一些定位分子基因,如泛毒蛋白、定位溶酶體信號蛋白、CTLA4、信號肽。其中泛毒蛋白、定位溶酶體信號蛋白分別定位于蛋白酶體和溶酶體,但起到副作用,可能因為在表位上存在一些酶切位點,從而被降解,因而在抗原表位遞程過程中,選擇其它途徑可能值得研究。CTLA4則定位于抗原遞程細胞上的CT LA4細胞受體,也沒有表現出增強抗體的作用。信號肽則在體外提高抗原分泌,有1/5的動物引起中和抗體,并且完全保護病毒攻擊〔13〕。把口蹄疫VP1蛋白插入到乙型肝炎病毒(HBV)核心區的顯性表位C形成嵌合的核心-VP1病毒樣顆粒,并插入帶有hCG-β前導肽的真核表達載體,轉染Hela細胞,可以在細胞上清中通過掃描電鏡觀察到病毒樣顆粒,說明能成功分泌到細胞外〔14〕。

豬IgG恒定區作為細胞表位載體,免疫小鼠和豬均可以增強免疫反應〔15〕。連有GM-CSF和細胞表位的腺病毒載體免疫小鼠,結果表明可以引起較高的細胞免疫反應〔16〕。有研究在沒有分子佐劑的情況下,表達口蹄疫病毒細胞表位的核酸疫苗免疫小鼠,可以在沒有特異性體液免疫反應的情況下有50%小鼠(6/12)保護病毒的攻擊〔13〕。

一些特殊的載體也被用于口蹄疫核酸疫苗抗原。偽狂犬病毒糖蛋白B由于可以被吞噬和在細胞與細胞間的運輸,有研究以其作為口蹄疫病毒細胞表位的載體,發現當細胞表位插入在偽狂犬病毒糖蛋白B的N端兩個B細胞表位之間,引起平衡的細胞免疫和體液免疫反應,而當細胞表位插入在偽狂犬病毒糖蛋白B的C端的B細胞中間,可以增強中和抗體水平〔17〕。把口蹄疫VP1蛋白插入到乙型肝炎病毒(HBV)核心區的顯性表位C形成嵌合的核心-VP1病毒樣顆粒,以質粒形式免疫動物,相對傳統的只表達VP1的DNA疫苗,可以引起更強的免疫反應,特別是中和抗體水平,可能是因為形成特殊的三級結構,從而有增強免疫的作用〔14〕。

用重組病毒表達口蹄疫病毒衣殼蛋白多肽(P1),自然宿主在沒有中和抗體的情況下也能部分保護,而這種保護可能是由T細胞和細胞因子引起的〔18-19〕。而沒有引起中和抗體的原因,可能是 P1只表達于細胞質,而不能被B細胞識別〔19〕。以西門利克森林病毒為載體表達 P1蛋白,相對以質粒pcDNA3.1+為載體表達P1蛋白免疫小鼠能引起相對更強的免疫反應,且可以引起明顯的細胞凋亡,這可能是免疫增強的原因之一,可能還由于其自我復制原因〔20〕。這些研究都表明,P1作為抗原由于不能分泌到胞外從而不能有效引起中和抗體,然后加入3C能增加中和抗體水平。

在豚鼠的攻毒保護實驗中,偽狂犬病毒編碼口蹄疫P12A3C組能完全保護,而質粒編碼口蹄疫P12A3C或細胞表位組則部分保護〔7〕。顯示出活載體疫苗相對質粒為載體的核酸疫苗有更好的效果,但是由于活載體疫苗的病毒載體背景,限制了其廣泛的應用,因而研究者還在研究更高效的質粒載體疫苗。表達口蹄疫病毒P12A3C的基于辛德畢斯病毒的非復制質粒免疫動物,并沒有顯示出相對以PcDNA3.1為載體的傳統核酸疫苗有增強抗口蹄疫的特異性抗體的反應〔21〕。以有復制能力的犬腺病毒表達口蹄疫 VP1蛋白,可以引起體液免疫反應〔22〕。

由于核酸疫苗引起抗體水平低且慢,因而有研究,利用滅活疫苗和口蹄疫非結構蛋白3D來加強免疫,以質粒P1-2A3C3D和質粒 pGM-CSF初免豬,結果表明相對滅活疫苗有36倍的抗體反應,且能引起血清型間顯著的交叉保護〔23〕。把核酸疫苗和滅活疫苗或合成肽疫苗的優點融合一起,這為口蹄疫預防提供了新的方向。

2 口蹄疫核酸疫苗佐劑

2.1 分子佐劑 多種細胞因子佐劑或功能蛋白的基因被用于口蹄疫核酸疫苗佐劑,大部分都被證明可以起到促進免疫反應的作用,但是效果存在差異,然后由于抗原形式、免疫動物、佐劑、免疫途徑、載體、血清型等的差異,因而很難比較其免疫效果。以下就在口蹄疫核酸疫苗研究中,所使用的分子佐劑簡要概括。

編碼IL-15的質粒作為佐劑和編碼口蹄疫抗原基因VP1的質粒共同免疫動物,結果表明相對于口蹄疫抗原基因VP1單免組能夠顯著增強細胞介導的免疫反應,及引起更高水平的口蹄疫特異性中和抗體水平和在黏膜部位大量分泌IgA〔24〕。

IL-18有促進Th1和Th2免疫的作用,以及可能促進抗體產生,并被認為能有效地誘導IFN-γ產生,有研究稱IFN-γ對于口蹄疫的預防有很重要的作用。以DNA疫苗(pVIR-P12A-IL18-3C)共表達豬IL18來免疫豬,相對DNA疫苗(pVIR-P12A3C)可以引起更強的免疫反應和更高的保護率,表明IL18可以增強體液、細胞免疫反應〔6〕。

IFN-α不僅有抑制抗原的作用,還有免疫調節的作用,有研究表明IFN-α在細胞內有抑制口蹄疫的作用。rAd-pIFNα-VPe/rAd-pIFNα-VP1雙順反子免疫或 rAd-pIFNα與 rAd-pIFNα-VPe/rAdpIFNα-VP1單順反子共免疫,都顯示出相對不加IFN-α的VPe或VP1有更強的免疫反應,且雙順反子比單順反子共免疫能引起顯著的免疫增強反應,攻毒保護實驗結果顯示免疫 rAd-pIFNα-VPe或rAd-pIFNα-VP1豚鼠均能保護病毒攻擊,免疫VP1的豬也能保護病毒攻擊〔12,25〕。Ad5-A24(P12A3C)和Ad5-pIFNα共免疫也表明相對Ad5-A24能引起更強的免疫反應,豬在免疫后5天攻毒能完全保護病毒的攻擊〔26-27〕。

質粒pGM-CSF與pcDNA 3.1/P1-2A3C3D共免疫豬可以引起更強的特異性抗體和中和抗體反應,以及增加細胞因子 IL-8和 IFN-γ的分泌〔28〕。rAd-GMCSF-VPe和 rAd-GMCSF-VP1能引起相對rAd-VPe和rAd-VP1更強的體液和細胞免疫反應,刺激分泌 Th1和Th2型細胞因子〔16〕。

質粒pCEIS(編碼VP1細胞表位且以豬IgG恒定區作載體)和 pIL2S共免疫豬,相對質粒pCEIS單免能引起更高的T細胞增殖,而抗口蹄疫中和抗體并無顯著差異〔15〕。以IRES構建多順反子真表達載體pVAX-SG-IL-2,相對單順反子共免疫組或雙表位基因可以增強抗體反應和細胞增殖,及細胞因子分泌〔29〕。

IL-6和TNF-α以質粒形式與質粒pcD-VP1共免疫小鼠,均能引起高比例的IgG2a/IgG1,高表達IFN-γ和IL-4,及細胞毒作用,促使DC細胞成熟,特別是增強抗原特異的細胞免疫反應〔30〕。

rAd-GMCSF-VPe(VPe指VP1上的表位)引起更高的細胞免疫反應,而rAd-GMCSF-VP1引起更高的體液免疫反應,但中和抗體水平比滅活疫苗都低二倍以上,兩者聯合免疫可以完全保護口蹄疫病毒攻擊〔16〕。

補體C3d可以與B細胞上CD21結合,從而起到促進抗原攝取的作用。VP1和C3d/C3d受體順式連接到帶有信號肽的真核表達載體連接,免疫豚鼠,能促進體液免疫和細胞免疫反應,sVP1-mC3d3組有87.5%的保護率〔31〕。

以B細胞激活因子(BAFF)與質粒pcDNA 3.1/P1-2A3C3D共免疫豬,結果顯示BAFF并未增強抗體生成,因而不適合作為佐劑〔32〕。

2.2 化學佐劑 以化學佐劑左旋咪唑、(Tween 80)、布比卡因(bupivacaine)、乙醇、鹽溶液等與pcD-VP1共免疫小鼠,(tPA ,tissue plasminogen activatorleader sequence,a signal sequence)

表1 有關口蹄疫核酸疫苗文獻

結果表明左旋咪唑能引起相對最強的T h1反應,吐溫80則顯示出最弱的Th1反應,左旋咪唑可以引起相對鹽溶液約100倍的IFN-γ分泌,布比卡因只引起中等水平的抗體,及相對低水平的Ig2a〔33〕。以左旋咪唑作為佐劑,核酸疫苗(pVIRP12A-IL18-3C)免疫豬,相對單免疫 pVIR-P12AIL18-3C,可以引起更強的細胞和體液免疫反應,也有更高的保護率;且引起顯著的口蹄疫特異性的IFN-γ反應(P＜0.001)〔34〕。巴氏蘑菇提取物富含多糖,口蹄疫核酸疫苗及以巴氏蘑菇提取物為佐劑免疫小鼠,相對僅以疫苗免疫組能增強抗體水平和T 細胞增殖〔35〕。

2.3 納米佐劑 Hong-Ying Zhang等以編碼口蹄疫表位的質粒以水溶液的形式注射動物,能快速吸收,廣泛分布,但是利用率很低〔36〕。因而,口蹄疫核酸疫苗要有更高的利用率,就必須有適當的載體或佐劑,以保護質粒在體內不被快速降解。編碼口蹄疫P1-3CD基因的核酸疫苗以磷酸鈣納米顆粒為載體,體外轉染效率和商業的脂質體轉染試劑相當,免疫小鼠和豚鼠可以增強細胞免疫和體液免疫,且能夠保護病毒攻擊。編碼IL-15的質粒和口蹄疫抗原基因VP1的質粒以殼聚糖為載體,經鼻免疫小鼠,可以在黏膜組織分泌IgA抗體,和引起系統免疫反應〔24〕。有研究結果表明,編碼口蹄疫 VP1和細胞表位的核酸疫苗和聚乳酸乙醇酸(PLGA)免疫動物,可以增強免疫反應〔37-38〕。

3 口蹄疫核酸疫苗的遞送方式

核酸疫苗一般通過肌肉注射,皮下注射、鼻黏膜免疫,經口免疫。氣霧傳播被認為是口蹄疫傳播的一個重要途徑,因而誘導黏膜免疫被認為是有效的預防途徑。而黏膜免疫分為經口、鼻、及肺黏膜免疫。利用殼聚糖來載口蹄疫抗原基因VP1和IL15基因由鼻黏膜免疫動物,可增強抗原特異性的黏膜和系統免疫反應,從而可能保護口蹄疫病毒在起始的感染〔24〕?？谔阋吆怂嵋呙缑庖哓i,實驗結果表明皮下注射相對肌肉注射能引起更高的抗體反應〔17〕。

4 討 論

核酸疫苗研究由于具備生產工藝簡單、可以長期保存、可以表達多種抗原基因、用于標記疫苗等優點,而受到廣泛研究,又由于口蹄疫核酸疫苗的諸多缺點,口蹄疫核酸疫苗的研究便成為一種有前景的潛在的疫苗。在抗原形式上,取得了一定的突破,但仍然不能在免疫原性和抗原基因的長度上達到平衡,也就是說既保證抗原基因上有足夠的細胞表位或片段來引起免疫反應,又不能加入太長的序列影響抗原基因的表達。另外,其它一些抗原形式被研究,如多順反子比單順反子共同免疫效果要好,細胞表位需要加入一些載體以提供一定的三維結構等。核酸疫苗的保護效果,特別是抗體水平與滅活疫苗所產生的抗體水平仍有很大的差距,為了增強免疫效果,一些細胞因子佐劑或分子佐劑被應用于核酸疫苗免疫,還有一些化學佐劑也被研究。對于分子佐劑,有 IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-6,IL-15,IL-18,IFN-α,IFN-β,IFN-γ,B-cell activating factor,GMCSF,C3d,4-1BBL、OX40L,IgG重鏈恒定區等被研究,但是由于抗原形式、免疫動物、佐劑、免疫途徑、載體、血清型等的差異,因而很難比較其免疫效果。

核酸疫苗的缺點,如插入基因組的可能性、免疫產生的抗體水平低從而保護率低?？谔阋吆怂嵋呙缫_到理想的效果,仍然需要研究抗原基因的作用機理,而使用合適的抗原形式;選擇合適的載體保證核酸疫苗被動物有效攝取,并能到達相應的免疫器官;選擇高效的表達載體,確保足夠的抗原基因在體內表達;篩選有效的佐劑,從而增強免疫;從而引起高效的免疫應答。相信,口蹄疫核酸疫苗的研究仍然有很大的挑戰,但也有廣闊的前景。

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R392.1

A

1002-2694(2010)09-0874-05

*歐盟項目FMD-DISCONVAC(G rant No.226556)

張永光,Email:zhangyg@public.lz.ys.cn

中國農業科學院蘭州獸醫研究所,家畜疫病病原生物學國家重點實驗室,農業部畜禽病毒學重點開放實驗室,甘肅 蘭州 730046

2009-09-28;

2010-01-04