銀杏達莫在內皮細胞氧化損傷中保護作用的實驗研究

崔 磊 矯春曉 李敬田 黃奇迅*

銀杏達莫（Geinkgo Leaf Extract and Dipyridamole Injection，GLED）是銀杏黃酮（Geinkgo Leaf Extract）、雙嘧達莫（Dipyridamole）等的復方制劑，具有擴張心腦血管、抑制血小板聚集及釋放等功能，在臨床上被廣泛應用于各種缺血缺氧性疾病。但其具體作用機制至今仍未完全明確。本實驗以H2O2造成動脈內皮細胞損傷模型，進行原代培養人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）及家兔血管內皮損傷試驗，觀察銀杏達莫在內皮細胞氧化損傷中的保護作用，初步探討其作用機制，為銀杏達莫更好的應用于臨床各種缺血性疾病提供一定的理論基礎[1-3]。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

銀杏達莫注射液（貴州益佰制藥股份有限公司），實驗前用完全培養液按遞倍稀釋法稀釋至所需濃度。MTT、胰蛋白酶（Sigma公司）；胎牛血清（上海勁馬生物科技有限公司）；微量MDA試劑盒，SOD試劑盒（南京建成公司）；PRMI1640培養基（濰坊醫學院生物化學與分子生物學實驗室）；H2O2（30%）；青霉素，鏈霉素（魯抗醫藥）等均為國產分析純。

1.2 實驗組織及動物選擇

足月新生兒臍帶（煙臺經濟技術開發區醫院產科）；家兔（濰坊醫學院動物實驗中心）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

①正常對照組；②H2O2（終濃度150μmol/L）損傷組；③GLED干預組（400、200、100、50μmol/L）。

1.3.2 人臍靜脈內皮細胞培養

取足月新生兒臍帶（20～30cm，4h內），采用王皓等[4]方法（培養基為PRMI1640培養基）進行內皮細胞的原代培養及傳代培養。

1.3.3 銀杏達莫在HUVECs氧化損傷中的保護作用

HUVECs傳2～3代后取對數生長期細胞制備細胞懸液，培養板接種，37℃，5%CO2孵育24h后，按實驗分組隨機分10組：損傷組及干預組加入終濃度為150μmol/L H2O2進行損傷0.5h后，正常組及損傷組加入含20%FCS的RPMI-1640培養基；干預組分別加入各濃度銀杏達莫。培養4h后，收集細胞或培養液進行有關實驗。

1.3.4 MTT比色法測定HUVECs增殖率

細胞接種于培養板相關培養后，加入MTT（終濃度0.5mg/L），37℃，5%CO2培養箱孵育4h后，2500轉/min、4℃ 10min離心后吸棄上清液，加入二甲基亞砜100μL/孔，10min后于酶標儀上測570 nm處吸光度值（OD570）。計算細胞損傷增殖率，并依次應用OriginPro 軟件分析EC50。

2.2 銀杏達莫對動物動脈內皮氧化損傷的保護作用

2.2.1 動物實驗模型[5-9]

氧化損傷模型：參照實驗家兔血容量由耳緣靜脈注射H2O2（終濃度達150umol/L）；損傷保護模型：氧化損傷半小時后參照家兔血容量由耳緣靜脈注射銀杏達莫（終濃度達400μmol/L）。

2.2.2 實驗動物分組

隨即所選15只家兔分為3組，每組各5只，統一飼料、飲水室溫飼養1周后分組。①正常對照組：不予以任何處理，繼續以相同飼料、飲水室溫飼養。②氧化損傷組。③ GLED保護組，處理參照動物實驗模型方法。每周日處理一次，統一飼料、飲水室溫飼養，連續4周后取家兔腹主動脈HE染色，鏡下觀察動脈內皮結構。

2.1.3 銀杏達莫對家兔動脈氧化損傷的保護作用

腹腔麻醉家兔（戊巴比妥鈉30mg/kg體質量），快速剪開腹正中皮膚及肌肉，分離腹主動脈，洗凈處理后常規石蠟包埋、切片（4μm厚），常規H-E染色。

表1 銀杏達莫在HUVECs氧化損傷中的保護增殖率

3 實驗結果

3.1 MTT比色法測定細胞的增殖率

對H2O2造成的HUVECs氧化損傷銀杏達莫有顯著的保護作用，可提高損傷細胞的增殖率，見表1及圖1。

圖1 內皮細胞氧化損傷保護率

3.2 H-E染色觀察銀杏達莫在家兔動脈內皮氧化損傷中的保護作用

實驗結果顯示，較高濃度銀杏達莫對H2O2造成的動脈內皮損傷有比較顯著的保護作用。H-E染色結果分別為：①正常對照組腹主動脈壁層次清晰，內膜薄，中層平滑肌層無萎縮、厚度均勻，外層為疏松結締組織，見圖2-1。②損傷模型組腹主動脈壁層次欠清，可見內皮細胞脫落，內膜下炎細胞浸潤。中層平滑肌層明顯萎縮，外層為疏松結締組織缺如或稀少，見圖2-2。③ GLED保護組動脈各層與正常對照無明顯區別，未見炎細胞，分別見圖2-3、圖2-4。

4 討 論

H2O2產生的自由基（·OH）在機體內性質極為活潑，具有強烈的脂質過氧化作用，病理狀態下，過氧化物產生過多或抗氧化酶類活性降低，則可引發鏈式脂質過氧化，損傷細胞多種成分（膜磷脂、蛋白、核酸），以致使細胞死亡。本研究以H2O2誘導HUVECs細胞進入氧化應激狀態，可以發現內皮細胞氧化損傷后，細胞病死率升高，增值率下降，細胞清除自由基的能力下降；

圖2 H-E染色觀察銀杏達莫在家兔動脈內皮氧化損傷中的保護作用

自由基造成血管內皮細胞的損傷是多種缺血性疾病發生進展的關鍵因子，內皮細胞損傷被認為是動脈粥樣硬化的第一步和決定性因素。所以，清除自由基減少內皮損傷被認為是防治動脈粥樣硬化的必要途徑[10,11]。

實驗中各濃度的銀杏達莫，對H2O2造成的內皮細胞損傷均能起到一定的保護作用，并且有一定的濃度依賴性。說明銀杏達莫在缺血性疾病的防治中的作用可能與清除自由基有關，其具體機制還需進一步實驗研究。

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