野西瓜揮發油對人胃癌 SGC-7901細胞的抑制

凌 娜,于 蕾,鄒 翔,季宇彬

(1.哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心,哈爾濱 150076;2.抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心,哈爾濱 150076)

野西瓜(Capparis spinosa,CS)為白花菜科山柑仔屬植物,又稱老鼠瓜、刺山柑、瓜兒菜、槌果藤,維語稱“波里克果”或“卡盤”,是荒漠、半荒漠、干旱、半干旱地區極有栽培價值的抗旱植物[1].主要分布于歐洲、北美、大洋洲、亞洲西部,我國新疆、甘肅、內蒙古、西藏等省區.我國民間常用刺山柑醫治風濕性關節炎,具有鎮痛、消炎、抗凝血的功效[2].野西瓜的藥用部位為葉、果和根皮.其果實所含揮發油的化學成分已有報道,通過 GC-MS法對化學成分進行鑒定,共分離出 57個峰,確定了其中 53種化合物[3].但對野西瓜揮發油誘導腫瘤細胞凋亡的機制報道較少.本研究通過 MTT、SRB、克隆形成能力實驗及 Annexin V/PI雙染體外試驗來觀察野西瓜揮發油對人胃癌 SGC-7901細胞的生長抑制作用,并探討其作用機制.

1 實驗材料

1.1 藥品及試劑

野西瓜揮發油由哈爾濱商業大學藥物研究所提供.RPMI-1640干粉(美國 GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季青),胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶 (PI)、MTT、磺酰羅丹明 B(Sulforhodamine B,SRB)均為 Sigma公司產品,Annexin V細胞凋亡試劑盒(美國 Biovison公司),阿霉素(浙江海正藥業股份有限公司).

1.2 腫瘤細胞系

人胃癌細胞株 SGC-7901,由哈爾濱商業大學藥物研究所提供,于 RPMI 1640培養液中加入10%的胎牛血清,青霉素 100 u/mL,鏈霉素 100 mg/L,置 37℃、5%CO2孵箱中培養,3～4 d傳代 1次.

1.3 儀器和設備

CO2培養箱(美國 NBS公司),酶標儀(美國Bio-Rad公司),倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS公司),激光共聚焦顯微鏡(德國 Leica TCSNT),超凈工作臺(蘇州凈化設備廠),電子分析天平(Sartorius),TDL80-2B低速離心機(上海安亭科學儀器廠).

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測野西瓜揮發油對 SGC-7901細胞的抑制作用

取處于對數生長期的 SGC-7901細胞,消化后懸浮在一定量的培養液中,計數后調整細胞濃度為 5 ×104個/m L,接種于 96孔板,每孔 100μL,置37℃,CO2體積分數為 5%的飽和濕度條件下培養.待 24 h細胞完全貼壁后,試驗組加入揮發油至終質量濃度為 10、50、100、150、200 μg/mL;陽性對照組阿霉素的質量濃度為 0.01、0.1、1、10μg/m L;空白對照組加相同體積的培養液,每個劑量設 6個平行樣,繼續培養 72 h后,棄去上清液后,每孔加入 MTT染液 100μL(0.5 mg/m L),繼續培養 4 h,棄上清每孔加入DMSO 200μL震蕩5～10min后,使用酶標儀檢測 570 nm處吸光度,并按中效方程計算IC50

抑制率(%)=(1-試驗孔平均 OD值 /對照孔平均 OD值)×100%

2.2 SRB法檢測野西瓜揮發油對 SGC-7901細胞的抑制作用

將對數生長期的 SGC-7901細胞用胰酶消化后調成細胞濃度為 3×104/mL的細胞液,每孔 100 μL接種于 96孔板.培養 24 h后加入野西瓜揮發油至終質量濃度為 10、50、100、150、200和 300μg/mL,陽性對照組阿霉素的質量濃度為 0.01、0.1、1、10μg/m L;空白對照組加相同體積的培養液,每個劑量設 6個平行樣,同時測定此時細胞的 OD515值(T0).72 h后棄上清,加 50%的冷三氯乙酸(TCA)液,置 4℃冰箱中固定 1 h,倒掉固定液,用去離子水洗 5遍,干燥后加 4mg/mL SRB染液,室溫放置30m in;倒掉染液用 1%醋酸洗 5遍,過夜干燥,加濃度為 10mmol/L的 Tris緩沖液 150μL,10 min后測定波長為 515 nmOD值.用如下公式計算藥物對腫瘤細胞的抑制率,并按中效方程計算 IC50.計算細胞 50%生長抑制所需的藥物質量濃度(GI50);細胞完全生長抑制所需的質量濃度(TGI);殺死 50%細胞所需的藥物質量濃度(LC50)[4].

生長率%=[(T-T0)/(C-T0)]×100%細胞殺死率%=[(T-T0)/T0]×100%

其中:GI50為[(T-T0)/(C-T0)]=50%時的藥物質量濃度;TGI為 T=T0時的藥物質量濃度;LC50為[(T-T0)/T0]=-50%時的藥物質量濃度.C表示對照組細胞的 OD值;T表示加藥組細胞的OD值;T0表示加藥時對照平板細胞的 OD值.

2.3 克隆原形成試驗測定野西瓜揮發油對腫瘤細胞克隆原形成的影響

取對數生長期細胞,配制成單細胞懸液,計數后調整細胞濃度為 50～100個/m L,按 2 mL/孔將單細胞懸液接種于 6孔板內,培養 24 h后,加不同質量濃度的野西瓜揮發油,終質量濃度分別為 50、100、150、200、300 μg/m L,空白對照組和給藥組均各設 3個平行孔,野西瓜揮發油持續作用 14 d后,棄培養基,每孔用 PBS洗 2次,2 m L/次;無水甲醇固定 5 min,靜置干燥;1%結晶紫 2 m L染色 5～10 min后,用自來水沖洗掉多余的染料,室溫干燥;計數每孔大于 50個細胞的集落,根據下述公式計算各給藥組集落形成率,按照中效方程計算 IC50值:

2.4 Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測細胞早期凋亡

將對數生長期的 SGC-7901細胞,用胰酶消化后調成細胞濃度為 3×105/m L的細胞液,每孔1m L接種于 6孔板中.培養 24 h后加入野西瓜揮發油至終濃度為 50、100、150、200和 300μg/mL,陽性對照組阿霉素質量濃度為 5μg/mL;空白對照組加相同體積的培養液.24 h后收集細胞,冷 PBS洗細胞 2次,細胞數 1×105～5×105個/m L.將細胞重懸于 500μL的 1×Binding Buffer,然后加入 5 μL Annexin V-FITC和 10μL PI染色液,室溫避光孵育 5min;離心去上清,PBS洗 1次,最后將細胞重懸于 1 m L PBS,用激光共聚焦顯微鏡進行檢測并拍照.同時以不加 Annexin V-FITC及 PI的細胞作為陰性對照[5].

2.5 實驗數據處理

應用 SPSS11.5軟件對數據進行統計學處理,結果以±S表示,組間比較采用方差檢驗.

3 實驗結果

3.1 MTT法檢測野西瓜揮發油對 SGC-7901的細胞毒作用

實驗結果表明:質量濃度為 50～300μg/m L野西瓜揮發油對 SGC-7901細胞的生長具有一定的抑制作用,與空白組比較差異有顯著性,并且隨著濃度增加,抑制率逐漸增加,即具有劑量依賴關系,經直線回歸計算出野西瓜揮發油對 SGC-7901的 IC50為 145.5 μg/mL(見表1).

表1 野西瓜揮發油對SGC-7901細胞增殖的影響(MTT)

3.2 SRB法檢測野西瓜揮發油對 SGC-7901腫瘤細胞增殖的影響

SRB是一種蛋白質結合染料,粉紅色,可溶于水.此實驗方法的原理是 SRB可與生物大分子中的堿性氨基酸結合,在 515 nm的 OD讀數與細胞數呈良好的線性關系,故可用作細胞數的定量.用該方法觀察了野西瓜揮發油對體外培養的 SGC-7901細胞增殖的影響,結果如表2.

表2 野西瓜揮發油對SGC-7901細胞增殖的影響(SRB)

3.3 野西瓜揮發油對 SGC-7901腫瘤細胞克隆原集落形成的影響

克隆原細胞(Clonogenic cell)是指具有分裂能力的細胞.當單個細胞連續分裂 6代或 6代以上時,其后代所組成的集落便含 50個以上細胞.通過集落計數可對克隆原細胞做定量分析,它反映出單個細胞的增殖潛力.集落形成實驗結果顯示,野西瓜揮發油在濃度為 50μg/mL時,SGC-7901細胞集落形成率為 78.76%,并且隨著質量濃度的升高克隆原形成率逐漸降低,野西瓜揮發油對 SGC-7901細胞集落形成的 IC50為 160.04μg/mL.提示:野西瓜揮發油明顯抑制了 SGC-7901細胞分裂和集落形成能力,并具有一定的質量濃度依賴性(見圖1).

3.4 Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測細胞早期凋亡

應用 Annexin V聯合 PI雙染色,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察,正常活細胞 Annexin V和 PI均為低染;細胞凋亡早期的細胞膜完整,Annexin V高染,細胞膜呈綠色熒光,PI低染,細胞核不著色;凋亡中、晚期細胞則 Annexin V和 PI均高染,細胞膜呈綠色熒光,細胞核呈紅色熒光.

實驗結果可見,經過不同劑量野西瓜揮發油作用 24 h的 SGC-7901細胞中,出現凋亡早、中、晚期的 SGC-7901細胞,部分細胞的細胞核呈大小不等、形態不規則的碎片狀或梅花狀,為典型的細胞凋亡形態.對照組的 SGC-7901細胞 Annexin V和 PI均低染,未見凋亡形態的細胞(圖2).

4 討 論

圖1 野西瓜揮發油對SGC-7901細胞克隆原集落形成的影響

細胞凋亡(apoptosis)是指在生理或病理狀態下,細胞啟動自身基因調控機制而發生的有序的、主動的自然死亡過程,是正常細胞維持群體數量穩定,清除轉化細胞,防止癌變所必需的生命活動之一.它的異常與許多疾病尤其是腫瘤的發生發展有關.

細胞凋亡的早期事件之一是:細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidyl serine,PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外.目前應用 Annexin V聯合 PI雙染色法是檢測細胞凋亡較為理想的方法之一[6].PS位于正常細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中,Annexin V是一種分子質量為 35～36 ku的鈣依賴性磷脂結合蛋白,能與 PS高親和力特異性結合,它可以作為探針檢測暴露在細胞膜表面的 PS.碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種核酸染料,不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中、晚期的細胞和死細胞中,PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染.將 Annexin V標記上異硫氰酸熒光素(FITC),同時結合使用 PI拒染法進行凋亡細胞雙染后利用熒光顯微鏡檢測細胞凋亡[7].該方法可將凋亡早、中、晚期的細胞以及死細胞區分開來:正常活細胞 Annexin V和 PI均低染,不著色;凋亡細胞的早期,Annexin V高染,細胞膜呈綠色熒光,PI低染,細胞核不著色;凋亡中、晚期細胞則 Annexin V和 PI均高染,細胞膜呈綠色熒光,細胞核呈紅色熒光.與傳統方法比較,Annexin V聯合 PI雙染色法檢測凋亡細胞不需要固定,靈敏性、特異性高,結果更為可靠.其最大特點是檢測細胞膜尚未破裂的早期凋亡細胞,并可區別不同的細胞群體,以觀察這些細胞群中有無細胞凋亡過程.

圖2 FITC-Annexin V/PI雙染檢測野西瓜揮發油對 SGC-7901細胞凋亡的影響

本實驗以野西瓜揮發油作用于 SGC-7901細胞,通過 MTT法驗證野西瓜揮發油對 SGC-7901細胞的生長有抑制作用,且具有劑量依賴關系,72 h的 IC50為 145.5μg/m L,同對照組相比差異顯著(P＜0.01).SRB結果顯示低濃度的野西瓜揮發油通過抑制腫瘤細胞生長而起抗癌作用,其 GI50約為121.37μg/mL,當質量濃度達到 240.55μg/m L時細胞生長受到完全抑制,隨著質量濃度繼續增加至900.96μg/mL時有一半數量的細胞被殺死.采用Annexin V/PI雙染染色法,激光共聚焦掃描顯微鏡檢測到 SGC-7901細胞形態的變化.經過不同劑量的野西瓜揮發油作用 24 h的 SGC-7901細胞,出現凋亡早、中、晚期的細胞形態.研究還發現野西瓜揮發油可誘導 SGC-7901細胞凋亡,使腫瘤細胞內 Ca2+濃度升高,并降低細胞線粒體膜電位,且發生 S期周期阻滯[8-9].進一步說明了野西瓜揮發油通過啟動線粒體途徑誘導 SGC-7901細胞凋亡,進而抑制 SGC-7901細胞的生長.

[1] 張立運,楊 春.保護風蝕地的刺山柑[J].植物雜志,2004,1:3-4.

[2] 李學明,周淑芬,張順禮.槌果藤的藥理研究[J].新疆中醫藥,1986,2:32-35.

[3] 白宏進,趙小亮,劉文杰.刺山柑果實揮發油化學成分的研究[J].安徽農業科學,2007,35(9):2517-2518.

[4] SUN L Y,SHAO S H.Effects of Na2SeO3Detected by SRB Method on the Growth of SGC-7901 Cells[J].JBeihua Uni(Natural Science),2004,5(2):122-123.

[5] BERNAS T,ASEM E K,ROBINSON JP,et al.Confocal fluorescence imaging of photosensitized DNA denaturation in cell nuclei[J].Photochem Photobiol,2005,81(4):960-969.

[6] SGONC R,GRUBER J.Apoptosis detection:an overview[J].Experimental Gerontology,1998,33(6):525-533.

[7] 譚曉華,張亞歷,周殿元,等.細胞凋亡的方法學研究進展[J].腫瘤,1997,17(5):288-291.

[8] 王 崴,于 蕾,崔榮田,等.野西瓜揮發油誘導SGC-7901凋亡的初步研究[J].哈爾濱商業大學學報:自然科學版,2008,24(4):369-399.

[9] 凌 娜,季宇彬,于 蕾,等.野西瓜揮發油抑制人肝癌HepG-2細胞增殖作用[J].哈爾濱商業大學學報:自然科學版,2010,26(3):257-260,264.