細胞規?；a過程中的質量控制

趙 蕾 管 宇 梅建國 唐 娜 李坤林

（山東省濱州畜牧獸醫研究院 256606）

細胞規模化生產過程中的質量控制

趙 蕾 管 宇 梅建國 唐 娜 李坤林

（山東省濱州畜牧獸醫研究院 256606）

細胞大規模培養在生物制藥和疫苗生產領域是一項基礎工作，是整個生產工藝過程中的中心環節，具有十分重要的地位。細胞培養基質的優劣直接決定終端產品的質量與療效，因此嚴格做好細胞培養過程的質量控制顯得尤為重要。筆者從事細胞培養及規?；a多年，對細胞培養和規?；a過程中的技術環節有著較為深刻的體會?，F就這些相關問題和注意事項進行簡述和探討。

1 規?；毎囵B明確對工作者的基本要求

細胞規?；囵B不能完全等同于細胞生物學實驗室工作，生產者首先應具備的基本素質：（1）除掌握操作技術之外，尚需明白各種操作的基本原理。（2）須具備判定細胞生長好壞和是否發生污染的能力：對細胞生長的好壞要根據理論知識和自己的經驗來判定其生長的穩定性，并且根據判定結果來進行適當的應用；如果懷疑細胞被污染還要能夠對污染情況做出預判。（3）熟悉體外培養細胞的生存條件、細胞的生物學性狀及與此有關的基本理論知識。（4）應該具有較高的無菌意識：培養用品與非培養用品、已消毒與未消毒品、清潔區與污染區的材料應嚴格分開存放或單獨處理，避免溢出、濺出和產生氣溶膠，吸入或吸出液體時避免傾倒或觸碰細胞培養瓶瓶口。

2 確保細胞培養原料的質量可靠

2.1 培養基 規模化細胞培養對培養基的一致性要求非常高，一年之內所用培養基的批號不宜超過2個。

2.2 血清 觀察血清融化后的顏色和清亮度，顏色偏紅或色淺、有大量沉淀者不能使用；血清凍融后的最上層無色透明，活力最差，使用前應該搖勻；長時間凍存的血清融化后出現的沉淀物可能會抑制細胞生長，應棄去沉淀物；避免反復凍融；生產中盡量使用同一批號血清。血清溶化后應盡快用完，4℃保存期最好控制在2周之內。根據實際情況，血清的滅活步驟可以省略。

2.3 胰酶 （1）胰酶極易潮解，需儲存在冷暗干燥處；（2）需要低溫配制；（3）胰酶分散細胞的活性與其濃度、溫度和作用時間有關，不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣，所以應當具體情況具體對待；（4）Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質可降低胰酶的活性，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力最強，要選擇最佳環境進行胰酶的應用；（5）胰酶消化過度造成細胞損傷，所以應該控制好胰酶對細胞的消化時間。大規模快速操作過程中，由于血清中和作用，胰酶不必棄之干凈，但是某些病毒如豬乙腦病毒對胰酶敏感，應注意胰酶的殘留量，以免影響病毒增殖滴度。

2.4 水 培養用水中如果含有一些雜質，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導致細胞死亡，所以細胞培養用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質，金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養用水，常用玻璃或石英蒸餾器制備的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水，超純水的電導率應達到18.2M?，最好用龍頭瓶貯存，存放時間一般不應超過2周。

2.5 試劑 應選用分析純，一旦完成供應商評估做好選擇后，不宜輕易更換供應商，還要做到保質期內同一批號，以保證其質量穩定。

3 保持工作環節操作上的一致性

為避免造成人為的差異，應將所有操作程序如洗刷、消毒、配液等，制定出統一的規范和要求，并在一定時間內保持相對穩定。

3.1 洗刷與消毒 （1）培養瓶的清洗與消毒。浸泡：新細胞培養瓶使用前應先經自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸溶液(5%)浸泡過夜；培養后的細胞培養瓶清除培養基后應立即浸入自來水中，注意讓水能完全進入瓶皿中，不應有氣泡。刷洗：浸泡后的細胞培養瓶要用毛刷沾洗滌劑洗滌，以除去器皿表面附著較牢的雜質；洗刷時應特別注意洗刷瓶角部位；已掉毛的毛刷不可使用，以免裸露的鐵絲摩擦內壁而出現玻璃劃痕。浸酸：刷洗不掉的極微量雜質經過硫酸和重鉻酸清潔液浸泡劑的強氧化作用，可被除掉，清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，浸泡時，器皿要充滿清潔液，勿留氣泡，浸泡時間應達6h以上。沖洗：刷洗和浸酸后都必須用自來水充分沖洗，每瓶都得用水灌滿，倒掉，重復五次，然后用純化水重復沖洗3次。漂洗：先用蒸餾水充分沖洗，使之不留任何殘跡，每瓶都得用蒸餾水灌滿，倒掉，重復3次以上，再用超純水漂洗3次，晾干備用。包裝：包裝要及時，防止落入灰塵引起二次污染。滅菌：按規程操作，180℃干烤2～3h。（2）膠塞的清洗與消毒。新購置的橡膠塞在2%的NaOH溶液內煮沸15min，用飲用水沖洗后再用4%的鹽酸溶液煮沸15min；用過的膠塞，先經渡槽內的消毒液浸泡消毒后，隨后以1%洗液煮沸30min，再用刷子刷凈。用飲用水和純化水分別沖洗3～5遍后再浸泡在純化水中24h以上。精洗滅菌：撈出后，用超純水沖洗2～3遍后，晾干包裝，121℃濕熱滅菌40min。

3.2 配液 （1）各種培養用液(培養液、胰蛋白酶、Hanks 液、NaHCO3、抗菌素液)均應由專人負責配制，制備濃度精確、滅菌可靠；所有制備好的溶液和試劑瓶上都要有標簽，注上名稱、濃度、消毒與否和制備日期，并保證做到嚴格按規程進行操作。（2）培養基的配制注意事項：配制用水及調pH試劑用水均需新近制備；配制用器皿均需清洗烤干；采用15～30℃的水配制，充分溶解每一種成份，在配制過程中不需加熱助溶；控制調節pH用酸、堿加入量，保證培養基滲透壓；過濾完以后要進行無菌檢驗；在使用過程中要注意保存期限。

4 保證細胞培養條件和環境的穩定

4.1 溫度 35～37℃，特別是注意不要高于這個范圍的最高值，要對培養溫度進行定期的驗證。

4.2 氣體 95%空氣/5%CO2。

4.3 酸堿度 pH7.2～7.6(酚紅指示)，注意培養基經過過濾后，pH會有所升高，所以過濾后要進行pH的監測。

4.4 滲透壓 血漿滲透壓一般為290 Osm/kg，并且不可超出280～320 Osm/kg的范圍。

5 嚴格控制可能對細胞培養帶來的污染

細胞培養污染是指培養環境中侵入了對細胞生存有害的成分和造成細胞變異的異物，分為物理污染、化學污染和生物污染(細菌、霉菌、病毒、支原體污染)，細胞污染不能完全被消除，但能減少其發生的頻率和后果的嚴重性。

5.1 物理因素對細胞產生的影響和應對措施 細胞和細胞培養液等培養試劑暴露于放射線、輻射(紫外線或熒光)或過冷過熱的溫度中，可以引起細胞代謝發生改變，如細胞同步化、細胞生長受抑制甚至細胞死亡。所以使用前應將培養液恢復至室溫，培養用試劑應盡量避免存放于光照之下，保持細胞培養環境的溫度穩定。

5.2 化學性污染和應對措施 （1）血清：選用同一批次的血清，減少成份差異，新購血清使用之前要進行預試驗。（2）培養液及試劑：選擇高純度的試劑；正確的使用濃度、正確儲存；在保質期內使用；避免高壓蒸汽滅菌試劑中的化學物質殘留。（3）水：使用新鮮超純水。（4）培養用器皿：避免生產過程中有毒物質殘留、消毒劑和清洗劑的殘留、包裝紙殘留和操作時烤焦的瓶塞。（5）培養箱：避免CO2混有有毒氣體及消毒劑和清洗劑的殘留。

5.3 生物污染和應對措施

（1）容易發現的生物污染包括細菌、霉菌和酵母菌。細菌污染：污染迅速、黑色細沙狀，可有不同的外形，培養液渾濁變黃，對細胞生長影響明顯，有抗生素存在時可長期帶菌。霉菌污染：培養液清亮；培養2～3d出現絮狀雜質，細絲狀的團狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細胞仍可生長，但長時間則細胞的活力狀態變差。酵母菌污染：培養液清亮，培養瓶底部出現較大顆粒，單個或聚集成團，細胞仍可生長，但長時間則細胞的活力狀態變差。三種污染均來源于滅菌不徹底的培養器皿，污染的試劑與器材，空氣中常見菌，工作環境潮濕；人體帶菌。預防措施：要避免產生著三種污染均需要徹底滅菌，在有效期內使用；試劑用前檢菌；環境及設施消毒；正確的無菌操作方法。

（2）不容易被發現的生物污染：包括支原體污染、病毒污染和細胞污染。支原體污染：污染嚴重，難發現。顯微鏡下看不到，不引起培養液渾濁和pH改變，營養要求高，不容易用傳統的微生物培養法檢測到，難去除，不能通過過濾清除大多數抗生素對其無效。病毒污染：難發現，隱性感染，無病變，如1型圓環病毒感染，難清除，無法藥物控制，一旦污染只能廢棄，嚴格的宿主性，自限性，對操作人員存在潛在危險。細胞污染：難于發現，若出現傳代細胞的生長速度異常，考慮交叉污染。來源：支原體污染—被污染的種子批，人體組織及體液支原體，飛沫傳播，牛血清中的支原體。病毒污染—病毒生產過程中漏毒，細胞株帶毒，血清及其他動物源性試劑，人體帶毒。細胞污染—細胞系交叉污染。預防措施：支原體污染：保證細胞及血清的來源，確?；|和器材無菌，細胞培養時避免交談，操作結束時消毒臺面，定期檢驗，定期更換細胞，做好詳細的細胞記錄。病毒污染：要進行種子批的外源病毒檢驗和原輔料檢驗；建立良好的生產規章制度。細胞污染：同一時間只傳同一種細胞，每種細胞要有單獨的培養液及胰酶，建立細胞庫和種子批，定期更換細胞。

體外培養細胞是個系統的工程，在培養過程特別是規?；a過程中的很多因素都有可能造成生產的失敗，所以還需要做好詳細的培養計劃，把培養過程中的每個環節細化，把可能造成污染的因素提前排除或預防，各項操作要嚴格執行標準操作規程和各項規章制度，這樣才能保證生產出高質量的產品。

Q813.1+1

A

1007-1733(2010)06-0078-03

2010–03–14）