豬偽狂犬病診斷檢測方法的研究進(jìn)展及應(yīng)用

邢俊玲 高付城 （山東省武城縣畜牧水產(chǎn)局 253300）

近年來，全世界的畜類受到傳染的病毒種類和數(shù)量都有所增加，其中豬偽狂犬病毒就是其中一種。根據(jù)研究證明其屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科豬皰疹病毒I型(Su1d HerpesviruS I，SHv-I)，可引起包括豬在內(nèi)的多種家畜和野生動(dòng)物共患一種急性傳染病。該病對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重，主要引起的臨床癥狀有：仔豬高熱，中樞神經(jīng)病狀及較高死亡率，成年豬則長期潛伏感染，成為保毒宿主和主要的傳染源。世界上40多個(gè)國家均有本病的報(bào)道發(fā)生，國內(nèi)也有大范圍的流行，對全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文主要對血清學(xué)、分子生物學(xué)診斷與檢測方法，以及鑒別診斷方法進(jìn)行了綜述。

1 臨床診斷和病理組織學(xué)檢測

成年豬無明顯癥狀，母豬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎，仔豬表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，肌肉震顫，嚴(yán)重時(shí)四肢劃水樣運(yùn)動(dòng)，體溫升高達(dá)41～42℃。取樣本的腦和脊髓做組織切片，蘇木素-伊紅染色后觀察呈現(xiàn)非化膿性腦炎變化，其他大體剖檢特征不明顯。在神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可檢出A型核內(nèi)包涵體。

2 病原學(xué)診斷技術(shù)

此種方法也被稱為診斷PRV的黃金標(biāo)準(zhǔn)。病毒分離時(shí)可以采集病豬的組織有：腎臟、腦、肝、脾及扁桃體，勻漿后加上雙抗，接種到敏感細(xì)胞，直至出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變(CPE)。這種方法的敏感性較差[1]。

3 核酸探針檢測技術(shù)

探針技術(shù)由于其具有特異性良好、敏感程度高的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于PRV的診斷和檢測中。Rirtle等首次使用核酸探針技術(shù)鑒定了野外分離的PRV，從而獲得了流行病學(xué)的研究資料。其后，用生物素和地高辛標(biāo)記的探針從三叉神經(jīng)節(jié)診斷出PRV DNA，并進(jìn)行了原位雜交，從單細(xì)胞的水平上檢出存在的潛伏感染 (Maes等)。國內(nèi)也存在利用探針檢測技術(shù)的研究，采用32P探針標(biāo)記PRV全基因組和重組質(zhì)粒應(yīng)用斑點(diǎn)雜交技術(shù)，從而獲取培養(yǎng)物中的PRV存在的信息，能檢測出10pg的PRV–DNA，并具有較高的特異性(郭萬柱等1991)[2]。

4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測技術(shù)

4.1 常規(guī)PCR 80年代建立成熟起來的PCR技術(shù)，不僅給分子生物學(xué)的基礎(chǔ)理論帶來重大的進(jìn)展，也給檢測病毒提供了方便快捷的新技術(shù)，因?yàn)槠淇焖佟⑻禺?、敏感，且安全可靠等明顯優(yōu)勢，在檢測豬偽狂犬病毒方面得到了廣泛應(yīng)用。目前，主要根據(jù)病毒生存必須的糖蛋白基因和毒力基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，檢測的基因片段主要有g(shù)B、gD、gG和gE等，其中g(shù)D基因是該病毒的主要中和抗原基因。如Echeverria M G等以PRVgD 基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)了一對引物，利用PCR法對19頭豬的組織樣本進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明有15頭PCR反應(yīng)陽性，而病毒分離只得到了3株P(guān)RV。周復(fù)春等應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行了PRV的檢測，并對潛伏的感染部位也進(jìn)行了相應(yīng)的研究。其中檢出率最高的組織為三叉神經(jīng)節(jié)，幾乎為100%[3]。石建平等對常規(guī)PCR法進(jìn)行了改進(jìn)，提高PCR的效率，使PCR技術(shù)更趨于實(shí)用化，根據(jù)gD 基因設(shè)計(jì)一對引物，選用高速離心和短時(shí)間100℃水浴釋放模板，將試驗(yàn)縮短到 4h 內(nèi)完成[4]。2009年，陳本龍等根據(jù)gD 基因設(shè)計(jì)引物，成功建立了檢測PRV的PCR體系[5]。

4.2 鑒別PCR Katz等根據(jù)gE、TK基因設(shè)計(jì)的套式PCR能將PRV野毒株和不同疫苗株有效地鑒別開[6]。劉麗娜等設(shè)計(jì)了與PRV的gB、gD、gE基因的3對引物，建立了能有效區(qū)分野毒株和基因缺失疫苗毒的多重PCR診斷方法，敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，多重PCR可以檢測到106pg三基因缺失疫苗毒或756pg PRV野毒的核酸模板量[7]。

5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

ELISA是目前最為廣泛應(yīng)用的一種免疫檢測方法，也是被國際貿(mào)易制定檢測PRV的方法之一。它是以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固體載體上，隨后的一系列免疫學(xué)和酶促生化反應(yīng)都在此固相載體上進(jìn)行的免疫酶測定實(shí)驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)適用于實(shí)驗(yàn)室大批樣品檢查，產(chǎn)地檢疫，流行病學(xué)調(diào)查和無本病健康豬群的建立，目前，國際上有各種商品化ELISA試驗(yàn)盒出售。

Moutn(1978)[8]，Afshar(1987)[9]等分別建立了檢測偽狂犬病病毒抗體的間接ELISA方法。國內(nèi)蔣玉雯等(1988)[10]建立了檢測偽狂犬病病毒抗體間接ELISA方法，認(rèn)為ELISA敏感性高，且快速、簡便，適于大面積血清學(xué)調(diào)查。

5.1 gE-ELISA gE-ELISA是一種靈感度很高的ELISA，它是根據(jù)疫苗株缺失的糖蛋白構(gòu)建的一種鑒別ELISA。荷蘭學(xué)者 Van Oirschot 等(1988，1989)建立了檢測 PRV gE抗體的競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(gE-ELISA)。Herdchek公司和gE抗體檢測試劑盒是一種阻斷gE-ELISA，該方法是一種阻斷gE-ELISA，由于涉及到全病毒，因此存在一定的安全隱患，結(jié)合基因工程的發(fā)展，給新型gE-ELISA的發(fā)展和建立提供了思路，Kimman等(1996)將一段gE基因(60-1020bp)融合到PRVgG的信號(hào)序列下游，在昆蟲細(xì)胞中獲得表達(dá)，并以該表達(dá)產(chǎn)物和一種抗gE的單抗建立一種間接雙抗夾心gE-ELISA。

5.2 gC–ELISA gC是PRV病毒的一種主要糖蛋白但并不是病毒感染所必需的，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答且為病毒的主要中和抗原之一。Kit等利用牛傳染性鼻氣管炎病毒基因缺失株(IBRV)作為載體表達(dá)，gC作包被糖原，建立了gC–ELISA。該方法和許多種檢測方法比較，證明此方法特異敏感。Van Oirschot等ELISA和中和試驗(yàn)檢測感染豬血清，進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，gC–ELISA和gE-ELISA方法較為敏感。

5.3 gG-ELISA Marchioli和Cook等建立了阻斷gG-ELISA技術(shù)，該方法較常規(guī)ELISA方法敏感性低。唐勇等利用gG-ELISA區(qū)分出gG基因缺失疫苗豬和野毒感染豬。

6 乳膠凝集實(shí)驗(yàn)技術(shù)(LA)

乳膠試驗(yàn)?zāi)夹g(shù)是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將抗原先用乳膠包被，然后再與相應(yīng)血清反應(yīng)，幾分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果。王澤州等于2001年報(bào)道利用此種方法對四川省的20個(gè)豬場進(jìn)行了血清檢測，陽性率為14.7%，少數(shù)豬場陽性率達(dá)到95%。羅勇等利用乳膠凝膠實(shí)驗(yàn)技術(shù)對疑似豬瘟病的病豬進(jìn)行了豬偽狂犬病毒的檢測，230份血清中陽性率11%[11]。

7 血清中和實(shí)驗(yàn)技術(shù)(SNT)

SN是檢測病毒比較經(jīng)典的血清學(xué)方法，應(yīng)用比較方便，很多國家都采用此法檢測PRV。Boelaert F等應(yīng)用SN對比利時(shí)北部地區(qū)4個(gè)豬場的母豬進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，血清陽性率分別為68%、60%、43%、18%[12]。李曉慧等采用SN和LAT兩種方法對吉林省8個(gè)地區(qū)1050份血清進(jìn)行了檢測，確定吉林省PR血清陽性率為21.7%，兩種方法血清檢出率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析準(zhǔn)確性差異不顯著[13]。邱德新等應(yīng)用血清中和實(shí)驗(yàn)(SNT)和偽狂犬病乳膠凝集實(shí)驗(yàn)(LAT)診斷試劑盒進(jìn)行了PRV抗體效價(jià)測定和相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩種方法檢測結(jié)果符合率高，特異性強(qiáng)，LAT比SNT敏感、快速簡便和實(shí)用[14]。

8 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)

Gutekunst D E(1997)首次報(bào)道了利用微量瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢查豬血清中PRV抗體，由于AGID技術(shù)操作簡單。結(jié)果準(zhǔn)確，無需特殊設(shè)備，與SNT技術(shù)相比有很大的優(yōu)勢，因此適用于基層獸研單位和大型豬場的現(xiàn)場的定性診斷及豬群隱形無感染的普查。吳斌等(1997)將AGID和SNT進(jìn)行了比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與SNT的陽性符合率為94%，可以作為一種檢測偽狂犬病和抗體水平的檢測。代明娟等(2002)利用AGID技術(shù)對5個(gè)豬場進(jìn)行了抗體檢測，結(jié)果分析表明豬場的血清陽性率為80.0%，再一次顯示了AGID 技術(shù)的簡便和快捷[15]。

9 結(jié)語

目前，可以用來診斷豬PRV的多種檢測手段中，傳統(tǒng)檢測手段可靠，但往往操作較復(fù)雜，或耗時(shí)較長，實(shí)際應(yīng)用中有一定的困難。血清學(xué)檢測手段，尤其是研制成功的部分ELISA試劑盒操作簡單，方便，不需要使用昂貴復(fù)雜的儀器，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，特別是鑒別ELISA試劑盒可鑒別野毒感染和一毛免疫動(dòng)物，但一些ELISA方法還不夠完善。分子生物學(xué)方法特別是PCR技術(shù)，隨著研究的深入將更加趨于敏感、簡便、快速、實(shí)用。建立和完善用于我國的PR控制和消滅該病的診斷方法，是我國廣大獸醫(yī)科研工作者面臨的重大課題之一。

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