益生菌對豬腸道菌群的調(diào)控研究進(jìn)展

劉志林 （山東省聊城市畜牧局 252000）

隨著腸道微生態(tài)學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到益生菌對于維持動物腸道菌群平衡發(fā)揮著重要作用。本文綜述了豬腸道菌群的建立和分布、益生菌對腸道菌群的調(diào)控作用以及益生菌制劑的合理應(yīng)用等問題，旨在為益生菌的研究及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供知識儲備。

1 豬腸道菌群的建立及分布

仔豬出生時(shí)腸道內(nèi)是無菌的，分娩時(shí)由于受到母體產(chǎn)道、糞便及環(huán)境微生物的影響，在出生后的3～4h，腸道內(nèi)開始檢出大腸桿菌和鏈球菌。兼性厭氧菌作為第一批在仔豬腸道定植的菌株，在初生24h之后，大腸桿菌和鏈球菌菌數(shù)達(dá)到最大值。48h仔豬腸道內(nèi)開始出現(xiàn)可以在微氧環(huán)境中生存的乳酸桿菌；72h專性厭氧菌、擬桿菌開始在腸內(nèi)定植。仔豬體內(nèi)的菌群發(fā)育情況因個體差異而有所不同。其種類和數(shù)量隨動物年齡、食物、宿主對細(xì)菌、細(xì)菌與細(xì)菌之間相互作用而發(fā)生變化，這種變化存在整個生命過程中，并維持動態(tài)平衡，形成正常菌群。一般認(rèn)為仔豬從出生到斷奶后腸道菌的組成一直在發(fā)生連續(xù)的變化，直到育肥期才趨于平衡。在育肥期豬的腸道內(nèi)至少發(fā)現(xiàn)有30多個屬、100多種細(xì)菌(顧君華和王欣，2003)。

初生仔豬胃內(nèi)pH為5，幾小時(shí)后降為3～4，5周時(shí)為2～3，其后相對穩(wěn)定，因此耐酸菌和兼性厭氧菌為優(yōu)勢菌，主要為乳桿菌和鏈球菌。小腸液是弱堿性混濁液體，pH值為8.2～8.7，十二指腸中的膽鹽能抑制其中的細(xì)菌數(shù)目，因此，十二指腸內(nèi)細(xì)菌數(shù)目較少，到達(dá)空腸和回腸后數(shù)目和種類逐漸增多。在豬的空腸和回腸內(nèi)容物中，以乳酸桿菌和雙歧桿菌為優(yōu)勢菌群，其次是消化球菌、腸球菌、小梭菌和葡萄球菌。大腸pH接近中性，是豬消化道微生物活動的主要場所，其中盲腸和結(jié)腸是細(xì)菌定值最大部位，主要由厭氧菌組成，如擬桿菌以及大量的革蘭氏陽性菌。嚴(yán)格厭氧菌包括無芽孢菌(如真桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌、消化鏈球菌、消化球菌等)和產(chǎn)芽孢菌(如梭菌、槌形菌等)(張名濤等，2003)，而兼性厭氧菌比厭氧菌少10～100倍，常見的兼性厭氧菌有鏈球菌和乳酸桿菌。

2 益生菌對豬腸道菌群的調(diào)控作用

2.1 抑制病原菌的作用

2.1.1 與病原菌競爭黏附位點(diǎn)和營養(yǎng) 黏附能力通常被認(rèn)為是病原菌的一種重要的毒性因子(Firday和Falkow，1997)，致病菌與腸道黏膜表面受體結(jié)合粘附于腸道黏膜，是其定植并產(chǎn)生臨床癥狀的前提條件。因此，許多益生菌可以通過與致病菌競爭腸上皮微絨毛上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)上的相同復(fù)合糖(glycoconjugate)受體來達(dá)到阻止致病菌的定植(李樹鵬和趙獻(xiàn)軍，2004)。而營養(yǎng)的競爭發(fā)生在小腸上皮細(xì)胞，主要是由于益生菌能夠搶先吸收利用小腸上皮細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生存和繁殖，抑制有害菌在消化道的增殖。

研究表明，益生菌可以黏附于微絨毛的刷狀緣和黏膜層而不被腸蠕動沖走，并且參與其與致病菌之間生存與繁殖的時(shí)空競爭、定居部位競爭以及營養(yǎng)競爭，限制致病菌群的生存繁殖。Jin(1996a和1996b)報(bào)道乳酸菌可競爭性地抑制病原菌對腸黏膜的粘附，從而降低病原菌對宿主的侵害。Muralidhara等(1997)給剛出生的仔豬飼喂乳酸桿菌可以減少大腸桿菌的數(shù)目，試驗(yàn)結(jié)果證明糞便中乳酸桿菌與大腸桿菌的比例達(dá)到1280:1，而沒有飼喂乳酸桿菌組，其比例為2:1，此比例的提高可以保護(hù)動物抵抗腸致病性大腸桿菌的侵襲，預(yù)防腹瀉。

2.1.2 產(chǎn)生抑制病原菌生長的物質(zhì) 乳酸菌通過自身以及代謝產(chǎn)物與其它的微生物之間的相互作用，調(diào)整菌群之間的關(guān)系，維持和保證微環(huán)境中微生物群最佳優(yōu)勢組合以及這種組合的相對穩(wěn)定。某些乳酸桿菌和鏈球菌可產(chǎn)生細(xì)菌素(bacterin)、過氧化氫、二氧化碳、有機(jī)酸等(Robinson和Tamime，1990；Mishra和Lambert，1996)，它們在體外具有抑制沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏菌(Shigella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、變形菌(Proteus)、假單胞菌(Pseudomonas)和大腸埃希氏菌(E.coli)屬細(xì)菌生長的作用(Gilliland和Speck，1977；Ozbas和Aytae，1995)。

如乳酸乳球菌產(chǎn)生的Nisin細(xì)菌素可抑制鏈球菌、葡萄球菌及梭狀芽孢桿菌的生長，嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的分子量為3500的肽能抑制大腸桿菌DNA的合成，乳酸桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素可以特異性地抑制革蘭陽性菌(Alakomi等，2000)等；嗜酸乳桿菌、乳酸乳桿菌等可產(chǎn)生過氧化氫抑制葡萄球菌(Staphylococcus)的生長繁殖，使有益菌在細(xì)菌的種間競爭中占優(yōu)勢。

Williams指出，在母豬日糧中添加益生菌可增加腸道內(nèi)揮發(fā)性有機(jī)酸和細(xì)菌發(fā)酵終產(chǎn)物的產(chǎn)量，為母豬提供更多的能量，有助于母豬養(yǎng)分利用和產(chǎn)奶量的增加(杜晉平，2002)。張國龍等(1994)在35日齡斷奶仔豬日糧中添加0.2%～0.4%的蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)品，糞便中大腸桿菌總數(shù)明顯降低。

2.2 對腸道的營養(yǎng)作用

益生菌能直接產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)如維生素、氨基酸、短鏈脂肪酸、促生長因子等，參與動物體的新陳代謝，有的微生物在動物體內(nèi)生長繁殖時(shí)能合成核黃素、泛酸、葉酸、VBl2等B族維生素，參與機(jī)體某些重要的代謝反應(yīng)。益生菌產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸為大腸粘膜代謝提供了能源，也使腸道pH值和氧化還原電勢降低，有利于礦物質(zhì)鈣、鐵、鎂、鋅等的吸收(楚渠和彭云武，2004)。

給豬飼喂益生菌后，能夠使小腸粘膜皺裂增多，絨毛長度增加，黏膜隱窩加深，小腸吸收面積增大，從而更加充分的吸收和轉(zhuǎn)化飼料，以提高生產(chǎn)性能。

2.3 免疫作用

2.3.1 益生菌與體液免疫 SIgA是黏膜體液免疫的主要效應(yīng)因子，它能預(yù)防腸道蛋白酶的分解，形成黏膜上的抗體。它經(jīng)腸黏膜上皮細(xì)胞釋放到腸腔內(nèi)與腸黏膜表面的正常菌群混合存在，其在外分泌液中以雙鏈和四鏈的形式存在，具有多鏈性、黏膜親和性與抵抗蛋白酶作用的特性，比單鏈IgA更有抗原結(jié)合力，與IgA和IgG相比，SIgA可以從空間構(gòu)象上阻止病毒的附著，從而中和細(xì)菌毒素，限制細(xì)菌的繁殖，維持腸道內(nèi)的正常菌群平衡，在局部抗感染過程中起關(guān)鍵作用(李樹鵬和趙獻(xiàn)軍，2004)。當(dāng)SIgA抗體分泌增強(qiáng)時(shí)，提高免疫識別力，并誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子，通過淋巴細(xì)胞再循環(huán)而活化全身免疫系統(tǒng)，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。乳酸桿菌的代謝物和整個細(xì)胞等抗原物質(zhì)能通過M細(xì)胞進(jìn)入PP，激活Th2細(xì)胞，產(chǎn)生大量的IL-5，而IL-5是有效的IgA產(chǎn)生因子，能激活PP生發(fā)中心的B細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，在生產(chǎn)Ig的過程中向IgA 轉(zhuǎn)化，從而使得SIgA水平上升。

Perdigon等(1991)研究證明干酪乳桿菌能促進(jìn)腸道分泌免疫球蛋白IgA，增強(qiáng)宿主腸黏膜的腸道黏膜反應(yīng)。Lessard和Brisson(1987)給斷奶仔豬飼喂乳桿菌后，接種傳染性胃腸炎病毒疫苗，試驗(yàn)組血清中的特異性抗體IgG水平顯著高于對照組。

2.3.2 益生菌與細(xì)胞免疫 研究表明，益生菌能激活腸黏膜中巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答。活性酵母能夠提高免疫機(jī)能可能與其胞壁物質(zhì)( 即β－葡聚糖和磷酸化甘寡糖)和胞內(nèi)活性肽有關(guān)(Indegrrew，1999)，β-葡聚糖能提高動物細(xì)胞免疫能力，可能歸因于添加后刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞大量增生，后者通過噬菌作用破壞微生物和抗原的入侵(Macdonald，1995)。乳酸菌能夠激活巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，增加IL-1、IL-2、IL-6、IL-5，TNF-a等細(xì)胞因子的產(chǎn)生量。

雙歧桿菌具有免疫賦活作用，能激活機(jī)體免疫系統(tǒng)中NK細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，另外還能激活機(jī)體單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌功能。其機(jī)理可能是雙歧桿菌可易位進(jìn)入血液循環(huán)，被單核巨噬細(xì)胞吞噬，從而激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。

據(jù)報(bào)道，口服或者腹腔注射乳酸桿菌能明顯提高仔豬巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的活性，引起白細(xì)胞數(shù)和血清總蛋白(主要是球蛋白)濃度的提高，增加小腸與結(jié)腸黏膜表面抗體的生成，從而有效提高機(jī)體的抵抗能力。

3 益生菌制劑的合理應(yīng)用

3.1 益生菌制劑所使用的微生物菌種及分類

我國目前允許使用的飼料級微生物菌種有15種。優(yōu)良菌種需具備的條件有：（1）對動物和人體無毒、無害、安全和無副作用；（2）具有存活能力并能進(jìn)行工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)；（3）經(jīng)加工后活菌存活率高、穩(wěn)定性好；（4）有利于促進(jìn)宿主的生長發(fā)育及提高抗病能力。

目前常用的益生菌種類主要有（1）乳酸菌：乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類可以分解糖類產(chǎn)生乳酸的總稱。目前已發(fā)現(xiàn)的這一類菌在細(xì)菌分類學(xué)上有18個屬，其中有益菌以乳桿菌屬、雙歧桿菌屬為代表，已被證實(shí)在臨床上能夠治療和預(yù)防人和動物的某些腸道疾病或者起保健作用(黃慶生和王加啟，2002)。（2）芽孢桿菌(Bacillus)：芽孢桿菌是一類好氧菌，在一定條件下產(chǎn)生芽孢。目前使用的菌株有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、東洋芽孢菌等。（3）酵母菌(yeast)：飼用酵母的種類主要有熱帶假絲酵母、產(chǎn)阮假絲酵母、啤酒酵母、紅色酵母等。

3.2 益生菌制劑的安全性

益生菌安全性評價(jià)一般包括病原性、毒性、代謝活性及菌株內(nèi)在特性作為指標(biāo)。現(xiàn)在多采用無特定病原和無菌動物來研究菌株的病原性及毒性，關(guān)于益生菌代謝活性安全性研究主要集中在它們是否產(chǎn)生氨、胺、吲哚、苯酚、致癌亞膽酸及降解黏膜的酶類上，通過細(xì)胞凝集活性來評價(jià)細(xì)菌表面特性。

雖然目前對益生菌安全性并沒有公認(rèn)的解釋，但綜合目前對益生菌的研究對益生菌安全性可以獲得如下的認(rèn)識：益生菌一定不能是致病菌而且不能產(chǎn)生有害物質(zhì)，菌株不能通過遺傳修飾獲得有害基因或者具有把有害基因轉(zhuǎn)移的潛力(袁鐵崢和姚斌，2004)。

4 小結(jié)

綜上所述，益生菌制劑能夠抑制腸道病原菌的生長與繁殖，從而起到保健和治療的作用。目前，益生菌制劑已廣泛應(yīng)用于我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中，然而大部分主要是益生素制劑對豬的生產(chǎn)性能方面的研究，而關(guān)于豬的免疫等方面的報(bào)道較少。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)培育出高質(zhì)量的菌株來提高飼喂效果以及深入研究微生態(tài)制劑對豬免疫功能的影響極其作用機(jī)制成為今后發(fā)展的重點(diǎn)。

[1]顧君華, 王欣. 國內(nèi)外飼用微生態(tài)制劑的研究進(jìn)展[J]. 中國家禽,2003, 25(6): 32-34.

[2]Firday B B and Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity revisitied. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1997, 61: 136-169.

[3]李樹鵬, 趙獻(xiàn)軍. 益生素與機(jī)體免疫作用研究進(jìn)展[J]. 家畜生態(tài),2004, 25(4): 134-138.

[4]Jin L Z. Adhesion of Lactobacillus isolates to intestinal epithe1ial cell of chicken. Leet Appl Microbiol, 1996a, 22(3): 229.

[5]Jin L Z. Effect of adherent to the intestinal epithelial cells of chicken.Leet-aook-microbiol, 1996b, 81(2): 201-206.

[6]Muralidhara K S, et a1. Effect of feeding lactobacilli on the coliform and Lactobacillus flora of the intestinal tissue and reces from pigs. Food Prot, 1997, 40: 288-295.

[7]Robinson R K and Tamime A Y. Microbiology of fermented maks.In:Robinson RK(ed). Dairy Microbiol. 1ondon: Elsevier Science Publishers Ltd, 1990. 247-280

[8]Mishra C and Lambert. Production of anfi-microbial substances by probiotics. Asia Pacific J Clin Nutr, 1996, 5: 20-24.

[9]Gilliland S E and Speck M L. Antagonistic action of Lactobacil1us acidophilus toward intestinal and food borne pathogens in associative cultures. J Food Prot, 1977, 40: 820-823.

[10]Ozbas Z Y and Aytae S A. Behaviour of Yersinia enteroeolitica and Aeromonas hydrophila in yogurt made with probiotic bacteria Bitldobacterium infants and Lactobaeillus acidophilus. Milchwissenschaft,1995, 50: 626-629.

[11]Alakomi H L, Skytta E, Saarela M, et a1. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(5) :2001-2005.

[12]楚渠, 彭云武. 益生菌菌種特性及主要作用[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(1): 65-66.

[13]Indegrrew W M. Yeast: could you have a business on this bug. In:Biotechnology in the Feed Induxtry. Nottingham University Press,Loughborough, Leics. UK. 1999, 15: 27-50.

[14]Macdonald F. Use of immunostimulants in agricultural applications[A]. In: Biotechnology in the Feed Industry[C]. Nottingham University Press, Loughborough, Leics. UK. 1995, 11: 257-267.

[15]黃慶生, 王加啟. 飼料乳酸菌類益生素的作用機(jī)制和應(yīng)用[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報(bào), 2002, 4: 12-17.

[16]袁鐵錚, 姚斌. 分子水平上益生菌研究進(jìn)展[J]. 中國生物工程雜志, 2004, 24(10): 27-31.

[17]張名濤, 顧憲紅等. 豬消化道微生態(tài)制劑及其調(diào)控研究進(jìn)展[J].獸藥與飼料添加劑, 2003, 8(2): 30-33.

[18]杜晉平. 益生素添加劑的作用機(jī)理[J]. 四川畜牧獸醫(yī), 2002, 29(11):32-33.

[19]張國龍, 李德發(fā)等.活菌制劑對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、氮平衡、糞中大腸桿菌及血清SOD酶活性[J]. 飼料研究, 1994, 9: 2-6.

[20]Perdigon G, et al. Immunoadjuvant activity of oral Lactobacillus casi:influence of dose in the secretory immune response and protective capacity in intestinal infections. Dairy Sci, 1991, 58: 485.

[21]Lessard M and Brisson G. Effect of Lactobacillus fermentation product on growth, immune respond and enzyme activity in weaned pigs.Anim Sci, 1987, 67: 509.