分子標記在種群遺傳學研究中的應用

黃文達,趙學勇,趙 昕,趙哈林,連 杰,王少昆

（1.中國科學院寒區旱區環境與工程研究所,甘肅蘭州 730000；2.中國科學院研究生院,北京 100039）

近年來,種群遺傳學已經逐漸發展壯大。這門學科有3個重要組成部分:有效檢測DNA信息片段的技術[1-2]；對DNA數據庫進行統計分析；方便快捷的計算機軟件應用[3],這使得利用分子遺傳學數據將生物固有的特性緊密地聯系在一起成為可能,從而在不同的生物等級中揭露其特有但至今尚未發現的信息[4]。目前,由遺傳數據得到的基因族譜信息和單基因位點遺傳標記技術,已經能夠有效地回答一些生物學問題,同時為進化生物學、種群生物學和保護生物學的發展也提供了技術支持。

1 種群遺傳學的研究進展

種群間不同個體的基因組DNA序列存在差異,這種變異通常發生在個體基因（或基因型）水平。某個基因是否會發生變異在時間和空間上受其他生物和個體的影響,而且變異會通過繁殖、遷徙、種群大小改變和自然選擇在個體間傳遞。利用種群遺傳模式,探討種群統計特征和分子遺傳變異分布之間的聯系[5],可以對有機體的生物學信息做出一定的推斷。遺傳變異對個體的影響最終導致對整個種群的影響,這個過程反過來也影響物種形成和物種的等級分類[6]。因此,利用不同的遺傳標記對個體遺傳變異水平進行研究,可以獲得任何一個種群及其進化過程中任一階段的正確信號和信息。

分子標記在種群生物學中的應用性,將為不同級別的種群生物學提供信息。首先,最敏感的遺傳信號是基因型數據組成（genotypic arrays）,運用微衛星定位的方法,通常能在抽樣個體中發現這種信號。在有性繁殖的物種中,這些數據組合會代代改組,因此有利于規模性種群的快速形成,例如親子關系和相互作用的個體之間的關系識別[7-10]。不過,在沒有頻繁遺傳重組的有機體中通常能識別這種數據組合[11]。其次,微衛星定位、線粒體DNA和其他的單基因標記也可以用于個體基因分析,揭示其發生重組的頻率和地理分布的遺傳分析。比起基因型數組,這些研究方法的變化在較大的時間和空間尺度上是有效的遺傳標記,這些標記可以說明基因流和種群史,即使是存在有限遺傳變異的物種[12-13]。第三,發生突變以后,新等位基因的產生過程會很慢,因此,新等位基因之間進化關系（等位基因和基因族譜,或系統發育）的分析是富有信息的。同時,這種過程也是系統地理學、形態學和較深的分類系統發育體系重建的長期過程[6]。

2 分子標記在種群遺傳學研究中的應用

用于種群遺傳分析的遺傳學技術,是一個令人費解的基因型數據組合[4]。但是,把研究重點放在技術本身不同的研究特性方面,會有助于對種群遺傳分析方法的理解。遺傳標記只是每個位點上具有豐富信息的遺傳特征。通常,在一個二倍體有機體內,每個位點上可以有1～2個不同的等位基因。所有的遺傳標記都能反映DNA序列的差異,因此,通常應該在數據的準確性和實驗操作簡便之間做一個權衡。每個獨立的位點都能對假設進行獨立檢測。因此,若許多個位點都分別對假設進行獨立檢測,將能產生大量敏感的數據組合。遺傳變異通常是按等級分布的,例如,一個個體內的2個等位基因,一個亞種群內的N個個體和一個種群內的Y個亞種群。因此,數據要能經得起分析檢驗,運用的方法要與生態學家們認可的主要統計學方法密切相關,包括方差分析、空間自相關因素分析等。與此同時,根據研究特性,對不同遺傳學技術進行篩選,以便得到較為可靠的遺傳數據,從而提高種群遺傳分析的準確性。

2.1 分子標記的選擇若要對某個種群進行遺傳調查,選擇恰當的遺傳標記將是一個良好的開端。遺傳調查時存在的主要問題和具體標記方法的屬性如下。

2.1.1靈敏性 用來解決問題的標記必須要有正確反映信息的能力。研究對象可能會存在很多遺傳信息（如果個體之間差異太大,那它們之間就沒有任何聯系）或很少的信息（沒有信號）。研究過程中不斷地進行數據積累,了解不同的分子標記能夠較為準確地表達不同水平的遺傳信息。在許多能夠恰當分辨的標記之間,應該選擇更切合實際的標記。

2.1.2多位點或單個位點 通常情況下,要考慮到遺傳標記的實用性和準確性2個方面。多位點DNA技術,如 RAPDs（DNA隨即擴增多態性）[14-22]、AFLP（擴增片段長度多態性）、RFLP（限制性內切酶片段長度多態性）[23]、ISSR（簡單序列重復）[24-31]、ITS區（DNA的內轉錄間隔區）[30-35]等；單位點技術,如常用微衛星和單拷貝核（scn）DNA區等。多位點的研究方法在技術上便于操作,但也存在很多明顯的弱點和局限性,其中包括利用這些方法檢測到的遺傳變異在很大程度上是非遺傳的或甚至不是源于目的有機體。這些缺點已經在植物、哺乳動物和鳥類研究中被證明[36-37]。相比之下,單位點標記更為靈活,內容豐富并且可以聯系在一起,因為可以分析基因型數組、等位基因頻率和基因族譜[38]。也有人認為,多位點技術更經濟[39]。單位點標記技術的發展,使得RAPD標記被忽視,其表現在一個高水平趨異進化的同形種、種內基因流和高水平的基因重組以及生物學更復雜的方面。但是考慮到比較數據組合的重要性時,單位點標記技術更為經濟[38]。

許多研究表明,種群遺傳分析不能使用多態位點的數據,主要因為多態位點技術不能提供的位點內和位點間等位基因的特性比較,從而對種群遺傳做出分析。但是,多態位點技術能產生許多可變帶,因此被廣泛地應用在基因圖譜構建和數量性狀分析中[40]。

2.1.3基因譜系 關于種群數量統計和基因譜系之間相關性的分析是種群生物學的一個主要發展領域,也催生了一些具有創新性的研究成果,種群的形成過程能幫助我們更好地理解種群生物學[3-4,6,13,41]。例如,分子系統發育是幫助從“小冰期”的影響中[41]理清當前的系統發育情況并獲得長期種群統計信息保護計劃的唯一途徑[6]?；蜃遄V的基礎是同源DNA序列的重組。一個染色體上的2個位點重組事件發生的可能性決定于它們的物理距離,因此遺傳連鎖圖譜可以作為物理圖譜的一種參考[42]。嵌套分支分析是制定一個特別清晰的統計數據和假設測試框架,并且可以通過計算機程序執行[41]。從種群形成的時間和空間的細節推斷可以找到一些參考信息,以及形成相應的基因族譜,從而更加確定其推論的準確性。因此,研究者收集不同生物種群的數據信息,并進行基因族譜分析,最終整合生物學和系統發育概念[43]。

2.1.4細胞器和細胞核DNA 大多數真核生物細胞中,含有可遺傳的雙親信息的核DNA,以及通?？蛇z傳的單親信息的細胞器DNA（線粒體和植物葉綠體）。信息傳遞方面的差異,以及一些進化模式的主要分歧,產生了細胞器 DNA和核DNA基因族譜,以反映種群生物學和種群歷史的不同方面。線粒體DNA較核DNA標記所得的Ne值小,并因此在多數種群分布統計情況下,線粒體DNA變種使得生物分類診斷變得更迅速。線粒體和核基因型的比較能幫助識別雜合體。非對稱雜交偏好和變種祖先類群的多態性隨機效應,能導致某些基因的系統發育樹與類群所攜帶的信息不匹配[41]。因此,一般最好使用一套能夠檢測這種跡象的標記。

如果遺傳標記能較早地開發,并且盡可能地篩選,就會使研究過程更加省時省力,從而有助于提高工作效率。在評估候選標記的相對適用性時,應該考慮技術操作的便利性。

2.2 遺傳數據分析種群遺傳分析最大限度地應用了最大似然法、貝葉斯統計學技術,以便從遺傳數據中提取大量信息[3,43-44]。利用DNA序列進行系統發生分析是分子進化研究的必要手段。要解決特定的系統發生問題,首先要挑選合理的分類群及序列,盡量減少數據的偏倚,然后選擇構樹方法,最后還要對結果進行評價并給出進化學上的解釋[45]?；蚪M程序化表達調控與生物體形態結構發生的相互對應是圖式遺傳學和系統生物技術研究復雜生物系統的核心[46]；基因族譜分析側重于研究同一物種不同種群內個體等位基因之間的進化關系[41]。這些技術（主要是“合并方法”[3,6,41]和“嵌套分化枝分析”[41]）能夠對歷史和空間的假說進行明確的測試,例如從以前的基因流中區分出目前受限制的基因流,調查受限制基因流的發展方向。最后,分子進化學的變化模型正在精細化,并且能大大提高譜系推理的合理性。這些發展能使人們了解種群生物學的基本進展。Luikart和 England[44]引用了26種不同的遺傳分析方法,對4種類型的種群生物學進行研究,其中包括關聯性和親子關系、擴散和遷徙、近親繁殖和有效的種群大小（Ne值）,實驗得到了一些全新的數據信息,而這些數據信息主要通過微衛星定位分析方法研究所得。微衛星定位分析的研究取得了很大進步,其中對非平衡態情況的遺傳分析,主要應用在保護生物學和入侵生物的研究中[13,41]。

種群遺傳學的當前繁榮主要源于方便快捷的電腦軟件,例如GENEPOP（http://www.cefe.cnrs-mop.fr/）、PH YLIP和 PAUP[47-48]。不過,盡管包括GENEPOP在內的電腦軟件之間的互補性大大促進了該領域的發展,但仍然有很大的發展空間[49]。

總的來說,隨著分子生物學研究的深入,越來越多新的分子標記技術最終會被發現,對各種種群遺傳變異分析也提出了新的挑戰,如何利用計算機程序和網絡信息對復雜數據的處理能力將成為今后種群遺傳分析的重點。

3 存在問題及展望

以DNA序列為核心的分子標記技術,即建立在PCR技術基礎上的DNA測序分析技術（DNA sequencing）。該技術的開發使DNA分子標記技術取得了突破性的進展[50-52]。近年來,由于DNA測序技術的發展使得人們對一些基因結構[53-55]、功能進化規律的認識更加深入,其中一些基因已用于動植物的進化與分類研究[26,56-60]。

目前,基于PCR的DNA直接測序技術在種群遺傳學中的應用己成為國際上相當活躍的研究領域。但文獻報道主要集中在歐美,我國在這方面的研究還相當滯后,僅見為數不多的報道,如一些特有物種[61]以及瀕危樹種的研究[62]。制約因素主要是技術應用存在局限性,實驗成本較高、操作過程中對實驗技術的要求較高等,使得用于種群遺傳學研究的方法很少。其次,數據分析的軟件也有一定局限性,常規的研究指標已經顯得比較單一。因此,作為方法學的研究,在種群遺傳學研究中還應加大研究力量的投入,選擇和發展出更適合種群遺傳學研究的分子標記技術。同時,僅僅依靠分子生物學技術在相當長的時期內還不能全面深入地解決種群遺傳學研究中的問題,應該選擇多種方法進行協同分析,比如分子標記技術與細胞學標記技術、生化標記技術等協同使用,從而促進種群遺傳學的進展取得更加輝煌的成就。

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