細菌內毒素檢查的幾點體會

張義偉

細菌內毒素檢查是利用鱟試劑與細菌內毒素產生凝集反應的機制，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法，是控制藥品質量的一項重要檢測項目。細菌內毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法［1］。其中廣泛使用的權威的方法是凝膠法。隨著細菌內毒素檢查法系統工程的標準化，藥品越來越多的家兔熱原檢查法被細菌內毒素檢查法所取代。筆者根據實際工作經驗，歸納在細菌內毒素檢查中的幾點體會，以資參考。

1 影響細菌內毒素檢查的因素

細菌內毒素檢查操作過程應嚴格按照無菌操作法，防止微生物的污染。實驗室應保持潔凈，實驗前應紫外燈滅菌1 h，在百級凈化臺上操作，動作盡量輕、小，防止試管受到振動。檢查所用器皿均應徹底洗滌干凈，以去除可能存在的外源性內毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60 min。凝膠法細菌內毒素檢查用水的內毒素含量應小于0.015 ml～1。某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液，一般要求供試品溶液的PH值在6.0～8.0的范圍內［2］。在此范圍內才能形成最佳凝集，PH值過高或過低均可破壞極微量的內毒素，也可影響鱟試劑與內毒素凝集反應過程。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調節被測溶液(或其稀釋液)的PH值。試液的每一步稀釋應在旋渦混合器上混勻。總之，盡可能避免假陽性或假陰性結果。

2 內毒素限值的確定

一個新品種的內毒限值確定的妥當與否，直接決定了對藥品本身所允許的內毒素含量標準質量的評價要求［3］。盡管細菌內毒素檢查方法的建立是一個科學方法的研究過程，但其最終目的還是要為控制藥品質量服務。因此，在方法建立時，不但要闡明限值的合理性，考慮技術可能達到的限值，同時還要滿足相關藥品管理法規的要求。標準要求太高可能會使正式生產時很多產品不能通過檢查，從而造成不必要的浪費，太松則不能保證藥品質量，危及臨床用藥安全。細菌內毒素限值(L)一般按以下公式確定，L=K/M。K為人每公斤體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，以Eu/(kg· h)表示，注射劑K=5Eu/(kg·h);M為人用每公斤體質量每小時的最大供試品劑量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或u/(kg·h)表示，人均體質量按60 kg計算，注射時間若不足1 h，按1 h計算。在計算過程中應注意單位的一致性。在細菌內毒素檢查中，細菌內毒素標準品和鱟試劑常常以Eu/ml表示，所以具體實驗中樣品的內毒素限值可以轉換為Eu/ml的。如某產品的內毒素限值為0.1Eu/mg，濃度為100 mg/ml，內毒素限值L=0.1(Eu·mg)·100(mg· ml)=10Eu/ml。注射劑臨床應用很多品種是聯合用藥，如一瓶輸液中可能加入多種藥物，也有幾瓶輸液同時注射。因此，在實險室對新品種內毒素理論限值計算后，還應結合多種因素，綜合考慮其內毒素限值的確定，這一點是很多藥學工作者所忽略的。

3 應注意細菌內毒素的“迭加現象”

試驗中使用的細菌內毒素檢查用水或其他材料均可能存在少量內毒素，但只要不超過鱟試劑的靈敏度，就不能檢出，然而它可增加供試品中含有的內毒素量，使其剛好在靈敏度限值以上，引起陽性反應。盡管出現這種“假陽性實驗”的情況是不可避免的，但可采用至少比供試品內毒素限值更小的鱟試劑來檢查細菌內毒素檢查用水或其他材料，減少這種“假陽性實驗”的出現。這種供試品的“假陽性實險”反應是安全的，因為供試品本身存在內毒素含量低于限值，它與含有超過內毒素限值，而被錯誤的通過是不同的。

4 錯誤認為一定要按最大有效稀釋倍數(MVD)或最小有效濃度(MVC)進行試驗

實際上，有的樣品濃度很高也不干擾鱟試劑與內毒素的凝集反應。這種情況下，只要供試品內毒素含量合格，可以在MVD范圍之內，即小于MVD的倍數下進行試驗，又如對樣品檢查時，也可以先用原液進行干擾實驗，如無干擾，內毒素檢查也能合格，則不必進行稀釋。這樣做的直接好處是可以節約成本和時間，減少污染環節。因此通過干擾實險，找到一個適當的不干擾試驗的供試品濃度，從而使操作更為便捷、經濟。

5 試驗結果的判斷

細菌內毒素檢查須陰性對照溶液均為陰性，供試品陽性對照溶液和陽性對照溶液均為陽性，試驗方為有效。供試品溶液管均為陰性，判供試品符合規定，如均為陽性，判供試品不符合規定。若有一管為陰性，另一管為陽性，需進行復試。復試時供試品溶液需做4支平行管，若均為陰性，判供試品符合規定，否則判供試品不符合規定。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部).化學工業出版社，2005:附錄 85-87

［2］郭錄平.淺談影響鱟試驗的影響因素.中國藥學雜志，1996，31(3):187.

［3］周孝文，李波.細菌內毒素檢查法常見問題.中國藥學雜志，2006，41(19):1516.