MUC蛋白mRNA在分泌性中耳炎積液中的表達變化

嚴麗英 劉 佳 趙海亮

深圳龍崗中心醫院(518116)

研究證實，分泌性中耳炎與咽鼓管功能不全、變態反應、感染等因素有關，但目前對其病因及發病機制尚未完全清楚。它的病發癥狀與中耳黏膜腺體和杯狀細胞的增生有必然聯系，這種黏膜高分泌所引起的中耳腔導致不易清除的黏液是其主要特征[1]。本實驗主要致力于大鼠分泌性中耳炎模型中耳黏膜中黏蛋白的分泌；揭示MUC在分泌性中耳炎積液的發生、發展過程中所起的作用，以便深入認識分泌性中耳炎發病機制，為臨床早期診治提供理論和實驗依據，并為分泌性中耳炎的預防和兒童聽力保護做出有益探索，為其臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物

選擇健康SD大鼠20只，雌雄不拘，體質量200～250mg，檢查未見鼓膜異常及積液征。隨機分為兩組。菌株選取:實驗組選擇分泌性中耳炎最常見的病原菌——流感嗜血桿菌經鼓膜注入細菌懸浮液0.1mL；對照組注入等量生理鹽水。

1.2 取材

術后1、3、7、14、18d，用1%苯巴比妥鈉將動物全麻，在手術時用顯微鏡觀察鼓膜的形態、顏色和色澤，然后斷頭迅速取下雙側聽泡。解剖顯微鏡下觀察鼓室內的黏膜及其積液情況。

1.3 方法

RNA的提取及RT-PCR實驗:總RNA提取各組每只大鼠左側聽泡予焦碳酸二乙酯(DEPC)水沖洗2次。采用異硫氰酸胍裂解法提取左側聽泡鼓室黏膜組織總RNA[2,3]，分光光度計測量260和280nm的光密度比值，判斷RNA純度和濃度。

引物設計及合成由上海博亞生物工程公司合成，RT PCR引物根據GenBank中MUC5AC基因(基因號:U44946)、MUC2基因(基因號:U07615)、GAPDH(基因號:X02231)用DNAMAN 4.0程序設計如下:

MUC5AC基因引物序列:上游:5ˊCATAGCCTCCTCTTGTTC；下游:5ˊATTCCTGTAGCAGTAGTGAG。 MUC2基因引物序列:上游:5ˊAGATCCCGAAACCATGTC；下游:5ˊGTTCCACATGAGGGAGAGG。GAPDH基因引物序列:上游:5ˊGCTGGTGCTGAGTATGTCGT；下游:5ˊ GAATGGGAGTTGCTGTTGAA。

RT-PCR按Invitrogen公司一步法RT-PCR試劑盒說明書。在DNA 擴增儀上進行RT-PCR:50 ℃ 30min合成cDNA，94 ℃ 2min預變性并活化Platinum Taq之后，按94 ℃ 30s→55 ℃ 30s→72 ℃ 45s，進行36個循環的擴增，最后72 ℃延伸7min。RT-PCR產物用1.0% Agrose電泳分離鑒定。

半定量分析電泳的結果經過Gene Snap成像后再選用Gene Tools進行半定量分析。以曲線下峰面積作為PCR產物含量，用目的基因與同一標本內參照基因(GAPDH)積分值作對比，比較結果可顯示該基因mRNA相對表達水平。

1.4 統計學處理

2 結 果

鼓膜情況:正常大鼠的鼓膜透亮，鼓室無積液，錘骨柄和光錐清晰可辨。造模后大鼠的鼓膜混濁，鼓室積液像，光錐消失。

術后1d，AP-PAS染色正常組和對照組中耳黏膜鼓岬處為立方或扁平上皮和薄層結締組織(固有層)組成，黏膜下層有少數纖維母細胞和少許膠原纖維以及中性多形核白細胞、淋巴細胞，光鏡下所有模型組咽鼓管上皮層次增多，黏液腺體擴張、數目增多，小血管明顯充血并有中性粒細胞浸潤和大量增多的分泌細胞。術后1周模型組鼓室黏膜上皮細胞和杯狀細胞明顯增生，炎性細胞浸潤明顯，電鏡下可見大量的杯狀(分泌) 細胞集結，表面有微絨毛，細胞內有大量成熟的亮顆粒和少許暗顆粒，部分排放到黏膜表面，呈游離的團狀。上皮細胞的內質網擴張，線粒體變形，核固縮或整個細胞結構不清。黏膜下毛細血管擴張充血，明顯增生。術后2周組和4周組出現成纖維細胞增生，有許多纖維母細胞和膠原纖維，新生血管增多，單核巨噬細胞浸潤，中耳黏膜明顯增厚。在細胞間和黏膜下層有許多黏液細胞和黏液滴。

總RNA中提取的RT-PCR結果將生物紫外分光光度儀(德國Eppendorf公司)下測其光密度(D)值，各樣品的D(260 nm)/D(280 nm)均＞1.7，這可以充分表明提取的RNA純度符合要求，1%瓊脂糖凝膠電泳可見明顯的18S和28S兩條帶，表明RNA具有良好的完整性。

預期的目的基因MUC2、MUC5AC片段長度分別為 356和391bp，MUC2在對照組中的耳黏膜呈弱勢表達，實驗組表達的明顯性越強，差別就越具有統計學意義。對照組中耳黏膜MUC5AC不表達，實驗組表達明顯增強，兩組比較差別有統計學意義(P＜0105)。

3 討 論

近幾年來耳鼻喉科的常見病癥之一是分泌性中耳炎，它是小兒聽力障礙的主要原因，嚴重影響著小兒語言的發育和智力的發展。特別提到的是慢性分泌性中耳炎，其病程長，遷延不愈。如不及時治療則易導致鼓膜萎縮、鼓室硬化、慢性中耳炎、膽脂瘤、膽固醇肉芽腫等。其發病與中耳黏膜腺體和杯狀細胞的增生有關，這種黏膜高分泌引起的中耳內出現不易清除的黏液是其主要特征[1]。黏蛋白是黏液的主要構成成分，是一種高度糖基化的大分子蛋白質，目前研究認為其高表達與中耳炎的發病關系密切。

到目前為至，人體中至少已有9種不同的黏蛋白被確認，且按其發現順序命名為MUC1～4、MUC5Ac、MUC5B、MUC6～8[4-9]。MUC1、MUC3和MUC4屬于膜結合性黏蛋白；MUC2、MUC5AC、MUC5B和MUC6屬于分泌性黏蛋白；MUC8仍不能確定。現已證明MUC2、MUC5AC、MUC5B和MUC6黏蛋白的基因定位于染色體11p15.5，人們認為它們來源于同一原始基因，因此它們具有結構和基因組織的相似性。MCUI定位于染色體1q21～ 24，Muc3定位于染色體7q22，MUC4定位于3q29，MUC7定位于4q13～21，MUC8定位于12q24.3[10]。由于黏蛋白基因的激活和滅活同時具備器官特異性和上皮細胞特異性，所以某種特定的上皮細胞其黏蛋白基因所表達的表達模式不同。

從總體看，黏液基因蛋白可被分成兩組:一為分泌性黏液基因蛋白(muc2、muc5B、muc5AC、muc6)，它以膠體形式存在于黏膜表面、膠體形式黏液基因蛋白的主要基因編碼作為一簇位于11p15染色體上。另一種為膜結合蛋白，存在于上皮細胞的表層，原來認為只有MUC1一種以跨膜形式存在，但現在發現MUC3、MUC4也都以跨膜形式存在。黏蛋白是由杯狀細胞分泌的，分布在上皮的表面，與細胞黏附，細胞保護、管腔表面潤滑、入侵微生物的捕獲以及腫瘤生物學等有關。黏蛋白多肽骨架的氨基酸序列有以下特點:高度串聯重復氨基酸序列組成的結構域(domain) 占極高比例；重復單位富含具羥基側鏈的絲氨酸和蘇氨酸；重復單位的兩側(N和C端) 富含半胱氨酸。成熟的黏蛋白羥基側鏈糖基化后形成O連接寡糖的糖蛋白；黏蛋白亞單位之間還可以通過半胱氨酸殘基的巰基(HS-) 側鏈相互作用形成二硫鍵，構成黏蛋白聚合體，使得黏液具有膠狀特點[11]。其中MUC1、MUC4 和MUC5AC 的表達始終局限于表面上皮細胞，前二者(為膜結合型黏蛋白) 表達于杯狀和纖毛細胞，MUC5AC 只在杯狀細胞表達。

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