遺傳標記在四川黑山羊研究中的應用

陳明華

（攀枝花市農林科學研究院畜牧水產研究所，四川 617061）

遺傳標記包括形態學標記（morphological marker）、細胞學標記（cytological marker）、生物化學標記（biochemical marker）、免疫學標記（immune genetic markers）和分子標記（molecular marker）5種類型。自從19世紀中期，奧地利學者孟德爾首創了將形態學性狀作為遺傳標記的應用先例以來，遺傳標記得到發展和豐富。形態學標記、細胞學標記、生化標記、免疫學標記等一直被廣泛應用，然而這些標記僅是遺傳物質的間接反映，都無法直接反映遺傳物質的特征，且易受環境的影響，因此具有很大的局限性。DNA分子標記直接反映DNA水平上的遺傳變異，能穩定遺傳、信息量大、可靠性高、消除了環境影響，可以反映生物的群體和個體特征。隨著分子生物學技術和分子遺傳學的迅速發展，分子克隆及DNA重組技術的日趨完善，DNA水平的遺傳標記得到廣泛應用。本文就生物化學標記和分子標記在四川黑山羊中的應用作一綜述。

1 生物化學標記

生化遺傳標記是隨著各種電泳技術的發展而興起的一種遺傳標記，以動物體內的某些生化性狀為遺傳標記，如血型、血清蛋白及同工酶。蛋白電泳所檢測的主要是血漿和血細胞中可溶性蛋白和同工酶中氨基酸的變化，通過對一系列蛋白和同工酶的檢測，就可為動物品種內的遺傳變異和品種間的親緣關系提供有用的信息。因蛋白電泳技術操作簡便、快速及檢測費用相對較低，且多態性比形態學標記和細胞遺傳標記豐富。已被廣泛應用于物種起源與分類研究和動物育種中。

余雪梅等［1］檢測了建昌黑山羊血清白蛋白（AIb）、運鐵蛋白（Tf）和酯酶（Es）3個基因座的多態性。結果表明，建昌黑山羊、臺灣本地山羊、西德有色山羊3個品種山羊遺傳距離均超過0.1，它們都是獨立的品種。江明鋒等［2］分析山谷型藏山羊、建昌黑山羊、安哥拉山羊乳中的 LDH、as-CN、β-CN、β-lg、SA 等基因座，結果表明，3個品種的 LDH、as-CN、β-CN、β-lg有多態，SA 無多態。其中乳LDH有A、B、C三種表型。As-CN有AA、AB、BB三種表型。β-CN和β-lg多為雜合的AB型，其它的電泳表型極少。乳SA為單態，定為AA型。王杰等［3］采用PAGE法檢測安哥拉山羊改良建昌黑山羊雜交后代F3的 Hb、Tf、Hp、Pr、Alb、Po、LDH、Akp 和 Amy 等基因座的多態性，結果表明，F3的 Hb、Tf、Hp、Akp 呈多態，Alb、Pr、Po、LDH、Amy呈單態；LDH 同工酶相對活力順序為LDH1＞LDH3＞LDH2 ＞LDH4＞LDH5；F3與安哥拉山羊Akp基因型分布差異顯著（P＜0.05），與建昌黑山羊差異極顯著（P＜0.01）；LDH1的相對活力與凈毛率呈極顯著負相關（P＜0.01），LDH5與兩型毛根數百分比呈顯著正相關（P＜0.05）、與兩型毛重量百分比呈極顯著正相關（P＜0.01）、與無髓毛伸度呈極顯著負相關（P＜0.01），LDH其他各條帶的相對活力與產毛性狀無顯著相關。湯守富等［4］研究了金堂黑山羊血液運鐵蛋白（Tf）、后白蛋白（Pa）及白蛋白（Alb）3個基因座的遺傳多態性。結果表明：金堂黑山羊群體中Tf和Pa兩個基因座均表現出多態性，Alb基因座呈單態；Tf和Pa兩個基因座基因型分布均符合Hardy-Weinberg定律。潘愛鑾等［5］研究了安哥拉山羊和建昌黑山羊及其高代雜種羊（F3）9個血液蛋白基因座的遺傳多態性。結果表明：建昌黑山羊血液 Alb、Pr、Pa、Tf、Hp、Hb、LDH、Amy 呈單態，Akp 呈多態。建昌黑山羊的平均基因雜合度與一致度分別為0.062 1和0.937 9。彭先文等［6］研究了建昌黑山羊等5個品種山羊及其部分雜一代的乳MUC1生化遺傳特性。結果表明：山羊乳MUC1呈現出多態性，基因型與山羊品種有關，建昌黑山羊有3種基因型，基因雜合度為0.495 0。鄭玉才等［7］研究了金堂黑山羊、巴普山羊等四川5個地方山羊品種及波爾山羊乳上皮黏蛋白MUC1的遺傳多態性。結果顯示，山羊乳MUC1表現出豐富的多態性；MUC1的等位基因、基因型及其分布存在品種間差異；山羊乳MUC1基因雜合度較大，遺傳變異程度高；根據乳MUC1等位基因頻率對6個山羊品種進行了聚類分析，能較好地反映各品種間的親緣關系。王杰等［8］分析成都麻羊和四川9個黑山羊品種（群體）酪蛋白多態性。結果表明，在供試山羊品種（群體）中β-CN呈單態，帶型為 β-CN （AB）；α-CN 均呈現 αs1-CN（H）、αs1-CN（L）、αs2-CN（CC）和 αs2-CN（CD）型，在建昌黑山羊和白玉黑山羊中，還存在αs2-CN（DD）型。在建昌黑山羊和白玉黑山羊中，αs2-CN（CC）和 αs2-CN（CD）的乳脂含量顯著高于αs2-CN（DD）的乳脂含量（P＜0.05）。

2 分子標記

由于分子生物學技術的飛速發展，重組技術DNA的完善及PCR技術和新電泳技術的出現，涌現出了大量的分子遺傳標記。與其他幾種遺傳標記相比，DNA分子標記具有大多數分子標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；在生物發育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速等優越性。DNA分子標記技術已廣泛應用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。

2.1 隨機擴增多態DNA

隨機擴增多態DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD），擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的多態性。這種多態性具有個體特異性，與RFLP等其他分子標記相比，RAPD具有DNA用量少、不需特殊的探針、靈敏度高、操作簡便、經濟快速等優點，現已廣泛應用于動植物遺傳作圖、基因快速定位、特殊染色體片段的鑒定和分離、性別鑒定以及群體遺傳變異的檢測。

鐘紅梅等［9］采用RAPD方法對藏山羊、安哥拉山羊、建昌黑山羊的巴普類群3個山羊品種（類群）的基因組DNA進行多態性和親緣關系研究，結果表明：3個山羊品種（類群）間的多態性大于品種（類群）內的多態性，藏山羊與安哥拉山羊之間親緣關系較近，巴普類群與安哥拉山羊之間親緣關系較遠。王杰等［10］對四川9個黑山羊品種（群體）進行RAPD標記研究。結果表明，引物OPQ-06未在樂至黑山羊中擴增出900 bp DNA片段，而在其他8個黑山羊品種（群體）中出現率均為1，可作為區分樂至黑山羊和其他8個黑山羊品種（群體）的分子遺傳標記。引物OPK-03未在江安黑山羊擴增出550bp DNA片段，在其他8個黑山羊品種（群體）中出現率均為1，可用于區分江安黑山羊和其他8個黑山羊品種（群體）的分子遺傳標記。李力等［11］在黑山羊群體中共篩選到5個分子標記分別與不同性狀相關，其遺傳基礎可能是該標記與控制性狀的QTL或主基因連鎖。朱金秋等［12］對四川黑山羊、南江黃羊、北川白山羊、成都麻羊4個山羊品種和藏綿羊進行RAPD分析。結果表明：黑山羊與南江黃羊的遺傳距離最小，親緣關系較近。

2.2 DNA指紋

以克隆或人工合成的探針進行RFLP分析，可同時檢測到許多高變區，產生相應譜帶，DNA指紋（DNA fingerprinting）圖具有高度變異性、個體專一性和組織穩定性，是一項非常有價值的技術。另外，以微衛星為基礎的寡核苷酸DNA指紋技術近年來也倍受研究者歡迎。DNA指紋技術可用于群體親緣關系、雜種優勢預測、基因定位、標記輔助選擇等方面。

晏兆莉［13］以人工合成的寡核苷酸（CAC）5/（GTG）5為探針，HaeⅢ酶切，采用地高辛（digitoxin）標記及檢測技術，構建山谷型藏山羊、安哥拉山羊及其雜種羊的DNA指紋圖譜。分析表明，山谷型藏山羊群體內遺傳差異大，而安哥拉山羊遺傳差異小，雜種羊群體內遺傳差異小于其母本山谷型藏山羊。在供試群體內，兩個無關個體具有相同 DNA 指紋的概率為 1.1×10－5～1.9×10－11，系本譜帶遺傳給后代的概率符合0.5的預期值。王杰等［14］應用寡苷酸探針（CA/GATA/TCC）5檢測安哥拉山羊和安哥拉山羊級進雜交F2、F3的DNA指紋圖譜。結果表明，供試羊只個體平均檢出18.2±0.4條譜帶；在安哥拉山羊及其 F2、F3中，探針的鑒別機率分別為 1.38×10-12、1.18×10-13、0.50×10-10；群體內DNA指紋平均相似系數安哥拉山羊及其F2、F3分別為0.453 9、0.407 7和 0.611 1；在安哥拉山羊DNA指紋圖譜中，發現2.3kb和8.6kb譜帶為特異性譜帶。王杰等［15］研究安哥拉山羊和建昌黑山羊及安哥拉山羊與建昌黑山羊級進雜交的F2、F3的DNA指紋圖譜。結果表明，安哥拉山羊、F2、F3的鑒別機率分別為 1.38×10-12、1.18×10-13、0.50×10-10；親子鑒定的父權概率W=0.988 9。王杰等［16］研究四川9個黑山羊品種（群體）的DNA指紋圖譜，結果表明，在供試黑山羊中，未發現有共同的譜帶和性別特異譜帶。9.0 kb和2.2 kb為建昌黑山羊共有譜帶，9.0 kb為金堂黑山羊共有譜帶，9.0kb、6.2kb和5.5 kb為白玉黑山羊共有譜帶，其余各黑山羊品種（群體）內無共有譜帶。

2.3 隨機片段長度多態

隨機片段長度多態AFLP（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術結合了RFLP和PCR技術特點，具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。重復性強、可信度高、多態性強、分辨率高，不需要Southern雜交，無放射性危害，且不需要預先知道被分析基因組DNA的序列信息，樣品適用性廣、遺傳性穩定，在遺傳育種研究、基因組研究中有著廣泛的應用前景。

王杰等［17］采用AFLP標記研究成都麻羊與8個黑山羊品種（群體）的遺傳多樣性。結果表明，供試8個山羊品種（群體）的遺傳多樣性指數在0.088 8～0.228 9之間，其中營山黑山羊的遺傳多樣性指數最大，白玉黑山羊最小，其余山羊品種（群體）介于其間。

2.4 微衛星DNA

微衛星DNA（microsatellite DNA）是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀簡單重復序列，微衛星DNA數量多且均勻分布在基因組中，具有豐富的多態性，并且微衛星位點檢測可以顯示純合子和雜合子。微衛星檢測容易、重復性較好、省時，適合于進行自動化分析等優點。已廣泛用于構建物種的遺傳連鎖圖譜、基因鑒定、物種演化和群體間遺傳分化研究等。

王杰等［18］對四川9個黑山羊品種（群體）進行微衛星DNA遺傳多態性研究，結果表明，10個微衛星座位在9個黑山羊品種（群體）中均為高度多態座位。嘉陵與營山黑山羊聚為一類；自貢與江安黑山羊聚在一起后，再與合江黑山羊聚為一類；金堂與樂至黑山羊聚為一類；白玉與建昌黑山羊聚為一類。最后4種聚為一大類。陳明華等［19］對四川9個黑山羊品種（群體）進行X染色體微衛星DNA遺傳多態性研究，結果表明，7個微衛星座位在9個黑山羊品種（群體）中均為高度多態座位，聚類結果與王杰等（2006）的結果一致。

2.5 線粒體DNA

造成線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）多態性的原因主要是堿基取代、長度變化和序列重排，因而可以利用限制性酶切技術直接檢測mtDNA的多態性。mtDNA以其分子量小、進化速度快（為單拷貝基因的5～10倍）、遺傳上具有自主性和嚴格的母系遺傳等特性而被廣泛應用于分子進化、親緣關系、畜群遺傳結構、雜種優勢預測和地方品種資源考察。

李祥龍等［20］研究了建昌黑山羊等來自國內18個地方山羊品種mtDNA的RFLP，研究結果提示我國地方山羊品種起源于兩種不同的母系祖先；我國地方山羊品種mtDNA遺傳多樣性比較貧乏，分化程度較低。王杰等［21］對成都麻羊與四川各地黑山羊品種（群體）mtDNA D-1oop序列多態性進行分析。共檢測到l0種單倍型，群體間共有多態座位83個，單一多態座位23個，簡約信息座位24個，平均核苷酸歧異度為0.001 510，D-loop序列多態性較貧乏。10個品種（群體）分為兩大類，合江黑山羊與江安黑山羊先聚在一起后，再與自貢黑山羊聚為一類，營山黑山羊與嘉陵黑山羊聚為一類，兩類形成一大類；成都麻羊先與金堂黑山羊聚在一起后，再依次與樂至黑山羊、建昌黑山羊、白玉黑山羊形成另一大類，最后兩個大類聚在一起。聚類結果與品種（群體）來源和生態地理分布相一致。

3 展望

四川省的黑山羊資源十分豐富，約有1 300萬只，遍布全省絕大部分地區。主要有建昌黑山羊、金堂黑山羊、樂至黑山羊、自貢黑山羊、合江黑山羊、江安黑山羊、白玉黑山羊、營山黑山羊、嘉陵黑山羊、美姑黑山羊等。近年來，為了促進地方經濟發展，先后命名了金堂黑山羊、樂至黑山羊、自貢黑山羊等地方品種。

除了從形態特征和生產性能鑒別分布在不同地區的黑山羊品種（群體）間的差異外，由于歷史和地域等原因，各個品種（群體）間的遺傳關系不是很清楚。雖然一些研究者［10，16-19，21］從分子水平研究這些黑山羊品種（群體）的遺傳多樣性，但是，為了對四川黑山羊品種（群體）進一步選育提高以及品種資源的合理保護和開發利用還需要更系統、更全面地從分子水平研究這些黑山羊品種（群體）的遺傳多樣性，了解這些黑山羊品種（群體）的進化歷史、分類地位和相互關系，從分子水平界定其是品種、不同生態類型還是雜交群體。

由于具有其他標記無可比擬的優點，分子遺傳標記在四川黑山羊群體遺傳變異研究、基因定位研究、群體親緣關系以及標記輔助選擇研究等方面有著廣闊的應用前景。

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