口蹄疫疫苗研究新進展

劉佑東（廣西柳州畜牧獸醫學校，柳州 545003）

口蹄疫（food and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（food and mouth disease virus，FMDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠距離傳播的動物疾病［1］。由于FMD暴發引起幼小動物死亡、成年動物生產能力降低，并由此而導致疫區畜產品禁運，造成重大經濟損失。因此該病被國際獸醫局（OIE）列為第一位A類烈性傳染病。目前，FMD呈全世界范圍流行趨勢。口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，該病毒有七個血清型。O型口蹄疫為全世界流行最廣的一個血清型，我國流行的口蹄疫主要為O、A、C三型及ZB型（云南保山型）。接種疫苗是特異性預防口蹄疫的有效手段，安全有效的疫苗是成功預防、控制乃至最終消滅口蹄疫的先決條件，在口蹄疫的防控中，最早使用的疫苗是滅活苗，長期以來，滅活苗在口蹄疫的防控中發揮了舉足輕重的作用，但同時也存在許多隱患，比如疫苗毒株毒力的返強造成二次感染等。隨著分子生物學、遺傳學及免疫學等學科的迅猛發展，口蹄疫疫苗的研究也取得了較快的進展，各種基因工程疫苗如亞單位疫苗、合成肽疫苗、重組活載體疫苗、核酸疫苗等不斷出現，為口蹄疫的防控開辟了新的途徑。本文就口蹄疫疫苗的研究概況進行綜述，以期為口蹄疫的有效防控提供新的途徑。

1 傳統疫苗

1.1 弱毒苗

弱毒苗是指經充分致弱，但尚能在動物體內增殖，接種后能夠引起動物發生無癥狀的感染，從而使機體產生堅強持久免疫力的病毒制劑。病毒毒力弱化途徑包括雛雞化、鼠化、兔化、雞胚化等。該種疫苗具有價廉、成本低及免疫原性好、抗體持續時間長等優點，但其引起免疫動物病毒血癥、長期帶毒、排毒及病毒返強等缺點卻一直無法克服，由于活疫苗具有上述缺陷，在很大程度上限制了其應用，為了使口蹄疫疫苗更安全，人們開始探索一種比較安全可靠的新苗。

1.2 滅活疫苗

滅活疫苗是指用物理或化學方法使口蹄疫病毒喪失感染力而保留抗原性，再添加佐劑后制成的制劑。滅活劑主要有甲醛、結晶紫、乙酰基乙烯亞胺（AEI）、二乙烯亞胺（BEI）、乙基乙烯亞胺（EEI）等。滅活疫苗研究主要有3個重要環節：獲取大量的病毒抗原、選擇適宜的滅活劑和滅活方法、選擇適宜的無毒副作用的免疫佐劑。1925年，Vallee等采集了FMDV感染牛的水皰液，經甲醛滅活，首次制成了FMD滅活疫苗。1926—1929年，Belin及其同事首次用FMD發病牛舌皮組織病料制造FMD甲醛滅活苗。1934年Schmidt和Hansen發現了無毒性且能增強免疫效力的氫氧化鋁膠佐劑。1935年荷蘭學者Frenkel用離體培養牛、羊、豬的胚胎皮膚，采用雞血漿固定組織塊的組織培養方法來培養FMDV獲得成功。1947年，Frenkel又用牛舌上皮細胞培養法發展了自己創造的組織塊Frenkel培養法，并用其增殖FMDV，使大規模病毒抗原生產技術獲得成功。1952年Dulbecco首先用胰蛋白酶消化動物的腎臟皮質獲得初代單層腎上皮細胞，用其培養FMDV獲得成功。但是在1938年至1962年期間口蹄疫疫苗主要由動物組織生產病毒抗原，經甲醛滅活，氫氧化鋁膠吸附制成［2］。自1962年至今，BHK-21細胞已成為制備口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想細胞培養系［3］，從而廣泛應用于口蹄疫疫苗生產。1965年Telling和Elsworth用發酵罐大量生產懸浮細胞來生產病毒抗原，現在幾乎所有的口蹄疫滅活苗都以這種方法生產，但有研究證明甲醛在抗原的滅活中有活毒的殘留，目前廣泛引用的滅活劑是二乙烯亞胺［4］。目前世界上主要應用滅活苗來實現對口蹄疫的防制，除了滅火的單價苗之外，滅活二價苗也早已出現，張永光、王永錄等已研制成功的牛口蹄疫O型A型雙價滅活疫苗［5］。在預防牛口蹄疫方面已取得了很好的效果。但越來越多的證據表明多次口蹄疫暴發與甲醛滅活苗有關，而氮丙啶類主要作用于核酸，蛋白抗原性保持較好，但毒性較大，從而引起的應激使動物的損失也較大，另外免疫性較差，所用種毒均為強毒，必須有嚴密的防范設施和嚴格的操作規程，存在生物安全隱患，生產難度大，成本較高，使用劑量基于上述問題，迫切需要進行新的口蹄疫疫苗研發。

2 新疫苗

鑒于傳統疫苗存在諸多問題，有關科學工作者結合生產實際，開展新型疫苗的研制，朝著安全、高效、多價、經濟的方向發展。20世紀70年代以來，隨著分子生物學、免疫化學和生物工程學的深入發展，對口蹄疫新型疫苗的研究取得了較大進展，主要有：基因工程疫苗、合成肽疫苗、活載體病毒疫苗、核酸疫苗（DNA疫苗）及綠色疫苗等。

2.1 基因工程亞單位疫苗

隨著生物技術在生物制品領域的應用不斷深化和發展，近年成功研制了許多基因工程亞單位疫苗。基因工程亞單位疫苗（subunit vaccine）又稱重組亞單位疫苗或生物合成亞單位疫苗，是利用DNA重組技術將編碼病原微生物保護性抗原的基因導入受體菌或細胞，使其在受體高效表達，分泌保護性抗原肽鏈，提取保護性抗原肽鏈并加入佐劑制成的亞單位苗。Kleid［6］等于1981年首次將口蹄疫保護性抗原基因VP1導入大腸桿菌，制備高純度VP1蛋白，接種牛可使牛抵抗強毒的攻擊。我國臺灣的Wang J H等，將大腸桿菌誘導表達的重組VP1蛋白應用SDS協助其重折疊，去除SDS，獲得純化的VP1單體和二聚體，后與口蹄疫抗體發生反應，結果表明任何一種形式的重組VP1豬用疫苗，都能產生免疫反應。鄭兆鑫等利用化學法合成了口蹄疫病毒VP1基因的兩種抗原表位序列，將其串聯后與半乳糖苷酶基因連接成融合蛋白基因在大腸桿菌中進行高效表達，提取的融合蛋白制成亞單位疫苗免疫豬后能有效地防制口蹄疫病毒感染。而且對不同地區分離的“O”型毒株均有很好的交叉保護作用。基因工程疫苗技術是一項新興的具有應用前景的生物技術。通過將不同血清型病毒或多種病毒的免疫原性基因偶聯于同一載體，可以制成多價疫苗或多聯疫苗，降低生產成本、簡化免疫程序，并且多聯苗還可克服不同病毒弱毒苗間產生的干擾現象，因此將是畜禽基因工程疫苗的重要方向。

2.2 合成肽疫苗

合成肽疫苗（synthetical peptide vaccine）是依據天然蛋白質氨基酸序列一級結構用化學方法人工合成包含抗原決定簇的小肽（20～40個氨基酸），通常包含一個或多個B細胞抗原表位和T細胞抗原表位。該疫苗是一種完全基于病原體抗原表位或者決定簇氨基酸序列特點開發設計的一類疫苗，不存在毒力回升或滅活不全的問題。特別是對于還不能通過體外培養方式獲得足夠量抗原的微生物病原體或雖能進行體外培養，但有潛在致病性和免疫病理作用等涉及安全性與有效性問題的病原體意義重大。合成肽疫苗的研究最早始于FMDV合成肽疫苗，研究重點主要集中在FMDV的單獨B細胞抗原表位或與T細胞抗原表位結合而制備的合成肽疫苗研究，雖然取得了一定的進展，但仍未獲得一種具有理想保護作用的合成肽疫苗。分析合成肽疫苗免疫效果不佳的原因主要有：疫苗缺乏足夠的免疫原性，很難如蛋白質抗原那樣誘導集體的多種免疫反應；B細胞和T細胞抗原表位很難發揮協同作用：缺乏足夠多的B細胞抗原表位的刺激。合成肽作為免疫原存在的一個普遍問題是主要組織相容性復合體（MHC）的限制性，FMDV是典型的細胞依賴性體液免疫為主，單純B細胞位點肽誘導機體產生保護性有限，因而T細胞表位的引入對提高肽段的免疫性意義重大。但T細胞表位的識別受MHC限制，非選擇性T11表位或病毒蛋白不同部分的特異性Tll表位的引入可極大解決這個問題。1990年Doel［7-9］分別用A、O、C血清型FMDV VPl序列的141-158和200-213肽段組成的40個氨基酸合成肽，在牛和豚鼠進行試驗，每個肽都產生高滴度的特異性抗病毒中和抗體，O、A型肽可完全保護豚鼠抵抗各同源病毒的攻擊，C型較差。2002年Wang［10］等以VPl G-H環及大量側翼序列為框架，將共有殘基整合進入VPl高變區位點，并引入外源Th位點設計的合成肽疫苗，免疫豬后，以Taiwan株FMDV攻擊時獲得20/21保護率。

2.3 重組活載體疫苗

活載體疫苗，是將微生物保護性抗原基因即目的基因插入載體病毒如痘病毒、皰疹病毒等的特定位置上，使載體病毒轉染細胞，在細胞中復制的同時表達外源基因產物即抗原。一個載體病毒中可同時插入多個外源基因，表達多種病原微生物的抗原、同時起到預防多種傳染病的效果。近些年來，除了以病毒作載體以外，還有利用細菌作載體的疫苗的研究。在口蹄疫病毒載體疫苗研究中，腺病毒是應用最為廣泛的載體之一。

腺病毒是一種單分子線狀雙股DNA病毒，基因組大小為34～43 kb，無囊膜，核衣殼呈20面體對稱，由252個殼粒組成，包括240個六鄰體和12個五鄰體及12根纖毛。除此之外，還有其他一些小蛋白，如Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅲα和Ⅳα2等。六鄰體形成病毒衣殼20個三角形面，12個頂端是5個五鄰體亞單位和3個纖毛蛋白共同構成的復合物，12根纖毛以五鄰體蛋白為基底，由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節區。五鄰體和纖毛的頭節區可與細胞表面的病毒受體結合，在病毒感染細胞過程中起著非常重要作用。腺病毒基因組兩端各有100～140 bp的一段末端倒置重復序列（inverted terminal repeat，ITR），這些ITR是病毒復制的起始位點，是病毒復制所必需的。在左端ITR的3′側有一段長約300 bp的包裝信號（ψ），主要是介導腺病毒基因組包裝病毒衣殼。對腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號約0.5 kb的序列是順式作用元件，也就是說，必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過輔助病毒（或細胞）反式補給。近年來，口蹄疫病毒基因重組腺病毒活載體疫苗研究的比較多，已有報道多是以E1和E3編碼區的AdHu5為載體，有些載體還缺失了E4編碼區。Sanz-Parra等構建了表達FMDV P1編碼區的復制缺陷型重組腺病毒，經鼻咽部和皮下兩種免疫途徑試驗證明，兩次免疫牛后可產生部分的保護性免疫反應。Mayr等構建了含有FMDV P1-2A-3C基因A24/A12嵌合型重組腺病毒，根據3C劃分為突變型和野生型兩株重腺病毒，試驗證實只有3C野生型重組腺病毒能夠將聚蛋白P1裂解為VP0、VP1和VP3，并刺激動物產生高水平的中和抗體，進一步證明了3C蛋白酶對衣殼組裝是必需的；此重組腺病毒免疫豬體后分別于7、14、42 d用同型病毒攻擊，具有很好的保護作用［11］。

2.4 核酸疫苗

核酸疫苗，常被稱作DNA疫苗、“裸”DNA疫苗、基因疫苗、多核苷酸疫苗、基因免疫、核酸免疫、多核苷酸免疫等。即把外源的抗原基因克隆到質粒或病毒載體上，然后將重組的質粒或病毒DNA直接注射到動物體內，使外源基因在活體內表達，產生以天然蛋白形式出現的抗原，激活機體的免疫系統，并能夠持續地引發免疫反應。核酸疫苗作為近幾年來發展起來的一項新的生物技術，無疑具有廣闊的應用前景，免疫期長、成本較低、容易構建和制備、穩定性好，抗原遞呈過程與病原的自然感染相似，但在短期內，DNA疫苗很難代替目前大量使用的傳統疫苗，隨著DNA疫苗研究的不斷深入，預計不久將會有新的突破。

3 展望

隨著分子生物技術的發展和在獸醫領域的應用及其基因表達技術的發展，使人類有可能在生物體外合成有生理活性的蛋白質及安全有效的細胞，病原抗原將為人類及動物疾病的防治開辟廣闊前景。因此可以認為在今后的口蹄疫防治方面，將可能研制生產出廉價、高效、安全的新型疫苗，為將來在世界范圍內控制并最終消滅口蹄疫提供了可能。

［1］謝慶閣.口蹄疫［M］.北京：中國農業出版社，2004.

［2］杜進鑫，王永錄.口蹄疫疫苗研究新進展［J］.生物技術通報，2009（3）：4-8.

［3］潘麗，張永光.口蹄疫疫苗研究進展［C］//中國畜牧獸醫學會口蹄疫學分會第九次全國口蹄疫學術研討會論文集.蘭州：中國農業科學院蘭州獸醫研究所，2003.

［4］Bahnemann H G.Binary ethyleneimine as an inactivant for foot and mouth disease virus and its application for vaccine production［J］.J Archives of Virology，1975，47.

［5］張永光，劉在新.牛口蹄疫O型A型雙價滅活疫苗研究［J］.中國獸醫科技，1995，25.

［6］Kleid D G，Yansura D，Small B D，et al.Cloned viral protein vaccine for foot and mouth disease：responses in cattle and swine［J］.Science，1981，214.

［7］Doel T R，Chong W K T.Comparative immunogenicity of 146S，75S and 12S particles of foot and mouth disease virus［J］.Archives of Virology，1982，73.

［8］Doel T R，Staple R F.The elution of foot and mouth disease virus from vaccines adjuvanted with aluminium hydroxide and with saponin［J］.J Biol Standard，1982，10.

［9］Doel T R，Pullen R F.International bank for foot and mouth disease virus disease vaccine：stability studies with virus concentrates and vaccines prepared from them［J］.Vaccine，1990，8.

［10］Wang X，Zhang X，Kang Y，et al.Interleukin-15 enhance DNA vaccine elicited mucosal and systemic immunity against foot and mouth disease virus［J］.Vaccine，2008，5.

［11］孫普，盧曾軍，劉在新.腺病毒載體及其在口蹄疫疫苗研究中的應用［J］.動物醫學進展，2007，28.