Bmi-1及p16在宮頸癌變過程中的表達及意義

伍 藝

(重慶市婦幼保健院 400013)

宮頸癌是嚴重危害婦女健康與生命的常見病，居女性癌癥死亡第2位，占女性生殖系統惡性腫瘤的首位。近年來，國內外研究表明，宮頸上皮腫瘤的發生、發展及預后與多種基因的變化密切相關。

近年來的研究表明，Bmi-1在胃癌、結腸癌[1-2]、肺癌、乳腺癌[3]等多種腫瘤中均有高表達[4]。p16基因又稱多腫瘤抑制基因(multipie tumorsuppressor，M TS1)，是繼 p53 基因之后的又一重要的抑癌基因[5]。近年來的研究表明在多種腫瘤中p16基因表達降低，如乳腺癌[6]、食管癌[7]、胃癌[8]，大腸癌。有研究表明在一些腫瘤中有Bmi-1基因表達增高并同時伴有p16基因的低表達。研究者發現Bmi-1基因與p16蛋白在小鼠淋巴瘤的發生過程中起協同作用。有學者發現Bmi-1 m RNA的表達水平在大腸癌組織中較癌旁組織顯著升高，高表達的組織中p16蛋白明顯低表達[9]。

但有關Bmi-1、p16與宮頸腫瘤關系的研究較少，本研究旨在檢測Bmi-1基因和p16基因在正常宮頸、宮頸上皮腫瘤、宮頸癌中的表達水平，探討二者在宮頸腫瘤中表達的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 87份宮頸組織標本均來自本院2008～2009年子宮頸活檢和手術切除的病理標本。年齡23～68歲，平均43.3歲。經病理證實正常宮頸上皮組織7例，CINⅠ級10例，CINⅡ級21例，CINⅢ級及原位癌組織17例，宮頸癌組織32例。均未做化學、免疫及放射治療。

1.2 試劑與方法 鼠抗人Bmi-1單克隆抗體、鼠抗人p16單克隆抗體、羊抗鼠IgG均購自Santa Cruz公司。免疫組織化學SP試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、EC L發光試劑盒均購自碧云天生物技術研究所。免疫組化SP法按試劑盒要求進行操作。用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。Western blot檢測，于4℃下，取宮頸癌組織及癌旁組織各 0.5～1.0 g，加入裂解緩沖液，粉碎勻漿后，4℃靜置 24 h，再于 4℃下 12000 r/min離心 20 min，提取總蛋白，并進行蛋白定量。經10%SDS-PAGE電泳、轉印、5%脫脂奶粉封閉，Bmi-1(1∶1000)、p16(1∶1000)4℃下孵育過夜;二抗(1∶5000)室溫下孵育2 h，EC L顯色。

1.3 結果判斷 免疫組化結果:Bmi-1陽性表達定位于細細胞核和細胞質，細胞核或細胞質出現棕黃色為染色陽性細胞。p16陽性同樣定位于細胞核和細胞質，胞核或胞質出現棕黃色顆粒為陽性細胞?？瞻钻幮詫φ盏募毎伙@色，陽性對照的細胞核和細胞質呈黃色、棕黃色或棕褐色。具體分類依染色細胞數及強弱而定，著色強度:無色(-)定為0分、淺黃色(+)定為1分、黃色及更深顏色(++)定為 2分;陽性細胞數:≤50%為定0分，＞50%～75%定為1分，＞75%定為2分。兩項得分相乘結果大于或等于2定為陽性。Western blot檢測結果經自動電泳凝膠成像分析儀進行，并進行灰度值測定。

1.4 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件，進行χ2檢驗、t檢驗。檢驗水準α=0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Bmi-1及p16蛋白在各宮頸組織中的表達 p16及Bmi-1在正常子宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及原位癌、子宮頸癌組織中表達的陽性率見表1。由表1可見，Bmi-1蛋白的陽性率基本呈遞增趨勢;p16蛋白的陽性率呈遞減趨勢。

表1 Bmi-1、p16在宮頸各組病變中的蛋白表達

2.2 Bmi-1及p16蛋白與宮頸癌臨床指標的關系 結果見表2。

表2 Bmi-1與p16在32例宮頸癌中的表達及其與臨床的關系

2.3 Western blot檢測Bmi-1、p16蛋白在宮頸癌及癌旁組織的表達 Bmi-1蛋白在宮頸癌癌旁組織中表達極少，而在宮頸癌組織中表達明顯。相反p16蛋白在宮頸癌癌旁組織中表達明顯，而在宮頸癌組織中表達減少。兩種蛋白含量在宮頸癌與癌旁宮頸組織的差異均具有明顯統計學意義(P＜0.01)，見表3。

表3 Bmi-1、p16在 18例宮頸癌及癌旁組織中的平均灰度分析()

表3 Bmi-1、p16在 18例宮頸癌及癌旁組織中的平均灰度分析()

檢測指標 癌組織 癌旁組織 t P Bmi-1 106.50±6.03 98.52±5.73 3.839 0.001 p16 97.96±5.94 104.96±5.50 3.388 0.003

3 討 論

近年來，子宮頸癌發病率呈年輕化傾向，35歲以下子宮頸癌的發病率出現上升趨勢[10]，且以中晚期患者為多，預后較差。以往關于宮頸腫瘤的研究提示，其發病與多種因素有關，例如人乳頭狀瘤病毒感染、多產、初產年齡、性行為、經濟狀況、吸煙、長期使用避孕藥等[11]。但近年來研究發現宮頸腫瘤是多基因、多因素協同作用所導致的。因此致宮頸腫瘤的基因作用是研究熱點。

Bmi-1蛋白屬 Ploycomb組蛋白(ploycomb-group，PcG)家族，是多梳基因家族中的一個癌基因。Bmi-1基因位于人染色體10p13，DNA 大小為4.9 kb，m RNA 為 3199 bp，含10個外顯子，326個氨基酸編碼序列。

p16基因是位于染色體9p21區的腫瘤抑制基因，是近年來發現的第一個直接參與細胞周期調控的抑癌基因，其編碼的pl6蛋白依賴激酶K4或K6的抑制因子，直接調控細胞周期G～S期，是人類惡性腫瘤最為常見的分子事件。研究表明，p16在對宮頸良性癌變、CIN或癌的鑒別診斷中優于目前所用的其他免疫組化抗體[12]。

本研究中發現在正常宮頸組織中Bmi-1陽性表達率為0，而p16陽性表達率為100%。在宮頸上皮內瘤變組織中Bmi-1陽性表達率逐漸增高，p16陽性表達率逐漸降低。在宮頸癌中Bmi-1陽性表達率明顯增高，pl6陽性表達率明顯降低。另外這兩種基因在CINⅢ級及原位癌組與宮頸癌組間差異有統計學意義，提示兩種基因在早期判斷宮頸腫瘤有一定的作用。為進一步探討這兩種基因表達與宮頸惡性潛能的關系，本研究分析了兩種蛋白表達在不同臨床病理指標間的差異，結果發現這兩種基因的表達與腫瘤的臨床分期及組織學分級相關，且組織學分級越低，Bmi-1蛋白的陽性表達率越高，而p16陽性表達率卻越低。另外本研究發現，Bmi-1蛋白在宮頸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，而p16在宮頸癌旁組織中的表達明顯高于癌組織，這也說明Bmi-1具有抑制子(repressor)的功能，可以阻斷細胞周期中的p16基因的位點，促進細胞轉化和腫瘤形成。

腫瘤的發生、發展是一個多步驟的過程，往往是在致病因素作用同時，多種基因同時或先后協調作用的結果。本研究發現，Bmi-1、p16基因與人體宮頸腫瘤發生、發展密切相關，Bmi-1和p16均參與子宮頸癌前病變、癌變的發生和發展。臨床上多種基因的同時監測，將有利于監控宮頸癌的發生、發展及預后的評估。

綜上所述，檢測Bmi-1、p16基因對判定宮頸癌生物學行為、預后和指導治療具有重要意義。Bmi-1、p16基因有望成為基因治療的新靶點。

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