聯合檢測ΔNp63、Ki-67和VEGF與膀胱移行細胞癌預后的相關性研究

伍 季，茍 欣，李云祥

(1.川北醫學院第二臨床學院泌尿外科，四川 南充 637000;2.重慶醫科大學附屬第一醫院泌尿外科 400162)

膀胱癌是人類常見的一種惡性腫瘤，約占全部惡性腫瘤的3%，在我國其發病率居泌尿生殖系腫瘤的首位。目前臨床常用的方法難以準確預測膀胱癌的生物學行為及預后。近年來許多腫瘤標記物相繼被發現可用于膀胱癌的預后判斷，但迄今為止幾乎沒有標記物可供臨床常規使用。目前有研究表明，ΔNp63與膀胱癌的生物學特性有一定的相關性，但其作用存在爭議。本實驗目的在于通過聯合檢測和分析ΔNp63、Ki-67和血管內皮生長因子(VEGF)在膀胱癌組織中的表達情況以探討其在膀胱癌發生發展中可能的作用及其相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取川北醫學院第二臨床學院病理科2006～2008年經手術切除的并有完整臨床資料的膀胱移行細胞癌(TCCB)標本56例，其中男34例，女 22例，年齡 30～82歲，平均56歲。病理分級按世界衛生組織(WHO)1998年標準確定，低級別(0～Ⅰ級)37例，高級別(Ⅱ ～Ⅲ級)19例。臨床病理分期按國際抗癌聯盟TNM分期(UICC-TNM)標準確定，分為淺表性腫瘤(Tis～T1)32例，浸潤性腫瘤(T2～T4)24例;初發30例，復發26例。以12例膀胱切開取石術及開放前列腺切除術患者的膀胱黏膜為對照組。

1.2 方法 應用免疫組織化學染色的方法，對患者的病理切片進行ΔNp63、Ki-67和 VEGF染色。鼠抗人 ΔNp63 Ig G單克隆抗體、鼠抗人 Ki-67核抗原、羊抗人 VEGF多克隆抗體、免疫組織化學染色SP試劑、DAB顯色試劑盒購自北京中山生物制品有限公司。按試劑盒說明書操作。

1.3 結果判定 由2位病理科醫生在臨床和病理資料不知曉的情況下進行觀察，2位觀察者重復觀察同一張病理切片進行結果判定。隨機選擇5個高倍視野，計數500個腫瘤細胞中陽性染色細胞，陽性表達率(PI)=(陽性表達腫瘤細胞數/500)×100%，ΔNp63抗原陽性表達表現為細胞核內出現棕黃色顆粒，PI＜25%為陰性，PI≥25%為陽性(圖1)。Ki-67陽性表達表現為腫瘤細胞核內出現棕黃色顆粒，以PI＜20%為陰性，≥20%為陽性(圖2)。VEGF陽性表達以腫瘤細胞及其附近的血管內皮細胞胞質出現黃色或棕黃為陽性染色，無腫瘤細胞著色或著色腫瘤細胞數小于10%為陰性表達，著色腫瘤細胞數大于或等于10%為陽性表達(圖 3)。

表1 ΔNp63、Ki-67和 VEGF的染色結果(n)

1.4 統計學處理 使用S PSS10.0版統計軟件作統計分析，ΔNp63、Ki-67和VEGF在膀胱癌中的表達及與臨床分期、病理分級的關系采用χ2檢驗，各指標陽性表達相關性分析采用S pearman等級相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ΔNp63、Ki-67和VEGF的表達與膀胱癌病理分級、分期及預后的相關性 ΔNp63、Ki-67和VEGF在正常膀胱黏膜、不同分級及不同分期膀胱癌組織中的陽性表達率見表1，結果表明，隨癌細胞惡性程度及浸潤程度增加，ΔNp63、Ki-67、VEGF的陽性表達有增強趨勢，其差異有統計學意義(P＜0.05);ΔNp63、Ki-67、VEGF在復發組中的表達均明顯高于初發組，其差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖1 ΔNp63在 TCCB中的陽性表達

圖2 Ki-67在TCCB中的陽性表達

2.2 ΔNp63與VEGF、Ki-67在 TCCB中表達的相關性ΔNp63、Ki-67和VEGF在膀胱癌組織中的表達情況經分別采用Spearman等級相關性分析，ΔNp63與 Ki-67、ΔNp63與VEGF均呈正相關，rs′分別為 0.316、0.322，其差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 ΔNp63與Ki-67、VEGF的相關性分析(n)

圖3 VEGF在TCCB中的陽性表達

3 討 論

p63是p53的家族成員之一，主要有 TAp63和 ΔNp63兩種亞型。p63在尿路上皮的分化和膀胱癌發生中起著一定的作用[1]。TAp63功能類似 p53，ΔNp63亞型無 TA區，不具備轉錄激活活性，是缺乏酸性 N端反式激活區的 p63，ΔNp63以顯性失活的方式抑制 TAp63和 p53，主要與細胞增殖有關[2]。ΔNp63在膀胱癌中的作用存在爭議，Park等[3]研究證實，ΔNp63在膀胱癌中表達增強，提示ΔNp63可能促成膀胱癌的進展 。Compérat等[4]研究證實，p63的表達在膀胱癌進展期間，尤其從低級別向高級別轉化過程中逐漸下降。何云鋒等[5]研究認為，ΔNp63與 TCCB的發生密切相關，可能為 TCCB發生的重要促進因素，但其表達水平和TCCB的臨床分期、病理分級沒有相關性，故ΔNp63在TCCB進展中的作用有待進一步研究。本實驗結果顯示，ΔNp63在TCCB中的陽性表達率顯著高于正常膀胱組織，并且與腫瘤的浸潤程度和病理分級呈正相關，在復發組的表達率顯著高于初發組，其差異均具有統計學意義(P＜0.05)。隨癌細胞惡性程度及浸潤程度增加，?ΔNp63陽性表達有增強趨勢。

ΔNp63與膀胱癌進展的作用機制目前尚不清楚。研究表明，Ki-67是一種增殖相關核抗原，與細胞周期密切相關，是判斷腫瘤預后的重要標記物，其表達越高預后越差[6]。Ki-67高表達的膀胱癌分化程度低、浸潤性強，可準確反映細胞增殖狀況，是研究腫瘤生物學行為和預后的一個重要參考指標[7]。而VEGF是內皮細胞特異的有絲分裂原，參與腫瘤營養血管的發生和構建，VEGF和表淺性膀胱癌的生物學行為最為密切，可作為表淺性膀胱癌的相對特異的指標。Yang等[8]取161例膀胱癌樣本用免疫組化的方式研究VEGF基因的表達情況，結果顯示，隨著臨床分期、分級的增高，VEGF基因表達的陽性率明顯提高。本實驗結果顯示，ΔNp63、Ki-67和 VEGF在 TCCB中的陽性表達與腫瘤的浸潤程度、病理分級及預后呈正相關，ΔNp63可能通過促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤血管形成發揮促癌作用，ΔNp63表達越強，細胞增殖越活躍，腫瘤的惡性程度越高，浸潤性生長和復發的可能性越大。

膀胱癌的預后判斷一直困擾著臨床醫生，臨床上采用的病理分級、分期方法曾為臨床提供了有益于判斷預后的資料，但仍很難準確預測膀胱癌的生物學行為及預后。近年來隨著對腫瘤分子生物學機制認識的深入，許多膀胱癌的預后判斷標記物相繼被發現，但迄今沒有任何一種標記物常規應用于臨床。膀胱癌的發生和發展是多因素、多基因影響的復雜過程，僅憑單一的腫瘤標記物不能全面準確地反映腫瘤的惡性潛能。一些學者進行了多指標聯合檢測判斷膀胱癌預后的研究，周占松等[8]檢測了p21、p185、p53蛋白在膀胱癌腫的表達，說明多個基因協同激活在膀胱移行細胞癌發生、發展中起一定作用。溫機靈和周祥福[9]認為聯合檢測 p53、p21、Ki-67和VEGF可以更加準確地預測膀胱癌的預后。Khaled等[10]經多因素分析顯示聯合檢測nm23-H 1、EGFR和p53是能用于預測高風險膀胱癌的生物學指標，并且認為除病理學因素外，聯合檢測2個或2個以上標記物對判斷預后有協同作用。本實驗采用免疫組化檢測了ΔNp63、Ki-67和VEGF在TCCB中的表達。結果顯示，由于ΔNp63在尿路上皮的分化中起重要作用，并且扮演了癌基因的角色，Ki-67是一種增殖相關核抗原，反映了腫瘤細胞增殖狀況，VEGF參與腫瘤營養血管的發生和構建，為腫瘤生長、浸潤和轉移提供適宜的條件。結果表明，ΔNp63、VEGF和Ki-67表達水平及與TCCB分化程度、浸潤程度及預后呈正相關，三者在膀胱癌的發生和發展過程中可能有協同作用，三者表達越高，腫瘤細胞的生長越活躍，發生浸潤和轉移的概率就越大，預后越差。聯合檢測ΔNp63、Ki-67和VEGF在膀胱移行細胞癌中的表達有助于膀胱癌的預后判斷，并為臨床治療選擇提供幫助。

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