miRNA在腫瘤研究中的進展

陳軍瑩綜述，姚德生審校

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科，南寧 530021)

微小RNA(miRNA)最早在線蟲中被發現[1-2]，結構上主要有3個特點:(1)本身不具有開放閱讀框架(ORF)及蛋白質編碼基因的特點;(2)通常的長度約為22個核苷酸;(3)有獨特的特征序列。很多學者認為miRNA對其靶基因主要為抑制作用，但是，2007年，美國哈佛醫學研究所在研究ARE的調控作用中發現，miRNA有活化翻譯的作用，即在細胞周期的調控中上調靶m RNA的翻譯[3]。在細胞周期停滯的情況下，識別TNF alpha m RNA中ARE的miRNA369-3能夠上調或活化m RNA的翻譯。通過構建其他3′UTR的報告基因，發現其他幾個miRNA同樣在細胞周期抑制的情況下活化基因的翻譯:let-7能夠活化含有H MGA23′UTR報告基因的翻譯;人工合成的miRcxcr4能夠活化3′UT R含有其識別位點的報告基因的翻譯。2008年，Orom等[4]發現與大多數miRNA總和m RNA 3′端結合的概念不同，miR-10a能與核糖蛋白的m RNA的5′TOP M otif功能性結合，并增強其翻譯。從這些研究結果看來，miRNA在功能發揮中可能只是起靶向識別的作用，而發揮何種功能則是由其結合位點和相應的結合蛋白決定。

1 miRNA與腫瘤的關系

miRNA在腫瘤中的作用主要在血管再生、細胞調亡、侵襲/轉移、細胞增殖、腫瘤發生幾個方面，近年來的一些報道見表1，由于miRNA與腫瘤的關系如此密切，以至于研究者們直接稱之為癌基因miRNA或抑癌基因miRNA。在大多數情況下，失調控的miRNA始終只上調或下調，但也存在一些不尋常的情況，例如，miR-181家族的成員在某些腫瘤中是上調的，如甲狀腺、胰腺癌和前列腺癌[5]，但在另一些腫瘤中卻是下調的，如膠質母細胞瘤和垂體腺瘤[6-7]。

表1 部分miRNAs功能

2 癌基因miRNA

2.1 miR-17-92簇 miR-17-92簇是定位于人染色體13q31的多順反子miRNAs[20]，共包括7個成熟 miRNAs分子:miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-20、miR-19b-1、miR-92-1。miR-17-92簇的表達水平在腫瘤組織中顯著升高，與多個癌基因或抑癌基因密切相關:(1)癌基因c-Myc。Olive等[21]用小鼠B細胞淋巴瘤Emu-myc模型，功能解剖miR-17-92簇單個組件發現:miR-19能夠激活Akt-m TOR通路，對抗pten蛋白，同時協同癌基因C-Myc，誘導細胞增殖，這些都證明miR-19是miR-17-92簇群中最重要的癌基因分子。Mu等[22]通過特定敲除miR-17-92的等位基因片斷實驗證實，在c-Myc誘導B細胞淋巴瘤的機制中，持續表達內生型miR-17-92是必不可少的條件，同時也證實，miR-19a和 miR-19b是 miR-17-92簇中絕對、充分的具有決定意義的癌基因miRNA。(2)抑癌基因PTEN。Xiao等[23]在小鼠的動物實驗中植入 miR-17-92高表達的淋巴細胞后，這些小鼠患淋巴細胞增生性疾病和自身免疫性疾病并過早死亡，有作者認為可能為miR-17-92抑制pten基因和促凋亡蛋白Bim。(3)抑癌基因 RB2。Wang等[24]發現miR-17-92與脂肪細胞分化有關，將miR-17-92穩定轉染至小鼠脂肪前細胞3T3L 1中，使得細胞分化，同時發現Rb2/p130 m RNA和蛋白數量在隨后的增殖階段中減少，使用siRNA敲減3T3L 1克隆增殖階段的Rb2/p130后，3T3L1細胞重現高水平miR-17-92;表明miR-17-92通過靶基因Rb2/p130影響細胞分化。(4)抑癌基因 p53。Yan等[25]發現在大腸癌中，miR-17-92簇與p53呈負相關，在包含野生型p53的低氧處理細胞中，miR-17-92減少，但在不含p53的低氧處理細胞中，miR-17-92水平不變，檢測發現miR-17-92與p53存在綁定位點，同時，miR-17-92的高表達抑制缺氧情況下的細胞凋亡，這都表明miR-17-92是p53在缺氧情況下的靶分子。

2.2 miR-21 MiR-2l位于染色體17q23.2上的空泡膜蛋白基因的3′UTR區，該區域經常在神經細胞瘤、乳腺癌、結腸癌和肺癌中表達增強，miR-21也被認為是經典的癌基因 miRNA:(1)在神經系統腫瘤中的研究表明，miR-21在惡性膠質瘤中的表達水平明顯上調，下調miR-21的表達可以觸發caspases的激活，從而導致腫瘤細胞的凋亡。最近有研究證明星型膠質細胞瘤的各個階段miR-21均升高[26]。(2)miR-21在乳腺癌組織中表達上調。在乳腺癌標本MDAMB-231中PDCD4和maspin的蛋白含量與miR-21的表達呈負相關，抑制miR-21的表達或增加TPM1的表達水平能明顯減少癌細胞的侵襲和肺轉移[13]。Wickramasinghe等[27]報道，miR-21在雌激素受體陽性的乳腺腫瘤中的表達比陰性的乳腺腫瘤高，證明雌激素能夠誘導miR-21的減少，這種抑制是α-ER誘導的，在miR-21受抑制后，其靶基因 Pdcd4、PTEN和Bcl-2蛋白表達增高，使用siRNA敲除α-ER可以阻止這3種基因表達升高。這些結果第一次用實驗證明E2通過激活雌激素受體，抑制癌基因miR-21。此外，還有研究表明，在乳腺癌細胞系中，骨形態發生蛋白-6(BMP-6)可以通過降低 deltaEF1和 AP-1來抑制miR-21[28]。(3)在消化系腫瘤的研究中，有研究用原位雜交分析(ISH)發現，miR-21在結直腸癌組織中的表達遠遠高于正常的結直腸黏膜，同時miR-21的高表達同樣可以在與癌癥相關的基質成纖維細胞中發現，這些現象提示miR-21的表達可以被腫瘤細胞因子誘導。PDCD4的表達與 miR-21呈負相關，是miR-21的靶基因。在內鏡檢查中，miR-21在癌組織中的表達遠遠高于與非腫瘤相關的息肉組織。使用LNA-ISH分析發現，miR-21可以提示癌前病變，并且在結、直腸腫瘤從腺瘤到進展期癌癥的過程中持續高表達。Meng等[29]發現，miR-21在肝細胞癌組織中上調，抑制體外細胞中miR-21后，PTEN基因表達上調，同時細胞增殖、侵襲能力下降，中心黏附激酶(FAK)、MMP-9、MM P-2表達下降，表明 miR-21可以抑制PT EN基因。此外，miR-21還通過負調控腫瘤抑制基因——原肌球蛋白1(tropomodulin，TPM1)、程序性細胞死亡4(programmed celldeath 4，PDCD4)和maspin來促進細胞的侵襲轉移。(4)Liu等[30]發現，miR-21在喉癌組織中高表達，用特異反義核苷酸敲除喉癌HEp-2細胞中的miR-21后，因為缺失由G1到S期的轉換調控，細胞數量減少，凋亡增加。

2.3 miR-10b Ma等[31]證明，miR-10b特異性地增加腫瘤細胞的侵襲，但不影響細胞的生活力和增殖。將過表達miR-10b的乳腺癌細胞系SUM159注射到小鼠乳房脂肪細胞中可以觀察到腫瘤細胞簇的肺部微小轉移，并有部分細胞轉移到胸膜。在乳腺癌細胞系中，miR-10b通過轉錄因子Twist的作用大量表達，進而抑制其靶基因抑瘤蛋白HOXD10的表達，同時增加介導細胞轉移蛋白RHOC的翻譯。實驗證明，HOXD10的過表達抑制RhoC蛋白的表達水平，能夠阻止miR-10b誘導的腫瘤細胞侵襲轉移[32-33]。另外，有學者使用RT-PCR技術，對 43例膠質瘤樣本和6個膠質瘤細胞系進行檢測發現，相比無腫瘤的腦組織，miR-10b在這些標本中均升高，且升高的水平與膠質瘤的惡性程度呈正相關，Rho C蛋白和尿激酶型纖溶酶原激活受體也與 miR-10b水平密切相關(P值分別為 0.009、0.014)。這些數據均提示miR-10b可能在膠質瘤的浸潤過程中扮演重要角色。

2.4 miR-155 miR-155由BIC基因(B cellintegration cluster)編碼 ，最初是作為轉錄物從禽白血病病毒ALV的整合位點中分離出來的。人類BIC基因定位于人染色體21q21，含3個外顯子，其中第3個外顯子編碼miR-155。由于缺乏足夠長的開放閱讀框架，BIC基因不能編碼蛋白質，所以其主要功能可能是產生miR-155。BIC基因活化可促進淋巴瘤和非白血性白血病的發病過程，而這兩種疾病又與癌基因c-Myc上調有關。miR-155在血液系統疾病中研究較為深入:miRNA-155在霍奇金淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤中表達水平明顯升高，尤其是在B細胞淋巴瘤中，可出現miR-155前體10～30倍的蓄積現象;而在非霍奇金淋巴瘤中幾乎不表達miR-155。miR-155很可能是細胞由炎癥進展到腫瘤的重要分子，Tili等[34]發現，許多血液系統疾病可以發現中等程度的miR-155過表達，轉入過表達的miR-155可以使小鼠細胞致癌，然而在炎癥應答中，有機體可以出現短時間的更高水平的miR-155表達，而為什么持續中等量的miR-155的過表達可以致癌原因不明。在實體瘤的研究中，miR-155是早期胰腺癌的可靠生物標記物[35]，能抑制凋亡激活因子TP53INP 1的活性。乳腺癌中miR-155也存在過表達。有學者通過生物信息學分析，推測細胞因子、化學增活素和轉錄因子可能都是miR-155的靶點，而最近發現的靶點是SHIP和C/EBPbeta，兩個都是白細胞介素-6信號通路上的重要調節因子[36]。

2.5 miR-221及miR-222 人甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中miR-221和miR-222高水平表達(增高11～19倍)與 KIT基因和蛋白的低表達同時存在，表明miR-221和miR-222對其靶基因KIT的負性調控可能與甲狀腺癌的發生有關。Garofalo等[37]通過實驗證實，miR-221和miR-222在非小細胞肺癌和肝癌中過表達，它們的靶基因是腫瘤抑制因子PT EN和TIMP 3，通過激活AKT途徑促進細胞轉移，同時此研究還證明，通過 c-Jun轉錄因子，癌基因M ET也參與miR-221和miR-222的活化作用。此外，還有研究表明，miR-221和miR-222在血管平滑肌細胞的異常增生中有重要作用，p27和p57是它們的兩個重要靶基因[38]。

2.6 miR-372及miR-373 miR-372和miR-373在人類睪丸生殖細胞腫瘤中高表達。Voorhoeve等[39]證實，miR-372和miR-373是通過阻斷RAS誘導的老化以及干擾 RAS介導的細胞轉化來使細胞對正常表達的p53等位基因所產生效應的敏感性降低，并認為具有正常p53功能的腫瘤組織中可能出現miR-372和miR-373的病理性表達水平升高。為了深入研究這兩種miRNA的致癌機制，他們進一步檢測了高表達miR-372和miR-373細胞的基因表達譜，發現這2個miRNA可能通過直接抑制腫瘤抑制基因LATS2的表達來阻斷p53介導的CDK抑制，從而促進細胞的增殖和腫瘤的生長。而在最近的關于人誘導多能干細胞的研究中，miR-371/372/373簇群表達了更好的組織特異性[40]，有待于進一步的研究。

3 抑癌基因miRNA

3.1 miR-15a/16-1 miR-15a和 miR-16-1，定位于人染色體13q14的LEU 2區域內，在人類慢性淋巴細胞白血病(CLL)中充當著抑癌基因的角色，是最早得到證實的與腫瘤有相關性的miRNA。在CLL患者中，Calin等[41]研究發現68%的C LL病例會發生13q14的缺失，miR-15a和miR-16-1是這個缺失區域內僅有的2個基因，它們的表達水平均下調或缺失。后來有研究結果顯示，抗凋亡蛋白 Bcl-2是miR-15a和miR-16-1的靶基因之一，miR-15a和miR-16-1可以從轉錄后水平負性調控Bcl-2表達。此研究結果提示miR-15a和miR-16-1可以被用來治療過度表達Bcl-2的腫瘤。現在，已知的miR-15a/16-1的直接靶基因有Bcl-2、MC L1、CCND1、WNT 3A 及miR-15a/16-1[42]，這些研究將為癌癥患者(特別是CLL)指引新的治療方向。

3.2 miR-34 miR-34家族定位在人類染色體1p36，一個在人類腫瘤(如神經母細胞瘤)中常發生缺失的區帶[43]。miR-34家族成員(miR-34a和miR-34b/c)是抑癌基因p53的直接靶分子;而p53是人類最常見癌癥的突變基因之一，可以激活一系列的轉錄產物，誘導細胞周期阻滯、凋亡及衰老。在多種癌細胞培養體系的體外研究中(如乳腺癌、非小細胞肺癌等)，無論是外源性還是生理性的應激均可通過p53途徑引起miR-34的高表達。許多腫瘤中經常可以發現miR-34a和miR-34b/c基因受到CpG甲基化的影響而失活。miR-34是p53基因信號通路的參與者，過度表達 miR-34至少可以通過CDK 4、CDK 6、cyclinE2、E2F 3、Bcl-2等誘發細胞周期停滯在G1期和抑制細胞增殖及集落形成，誘導凋亡。最近發現，MiR-34、SIRT 1和p53能夠形成一個環狀反饋機制，SIRT 1是一個調節細胞周期限制細胞壽命的基因，通過脫乙酰作用調控p53，進一步調節miR-34的活性，而miR-34又可以抑制 SIRT 1，形成一個正反饋環，使p53活性提高[44]。

3.3 let-7/miR-98 let-7/miR-98家族無所不在，是最早得到識別確認的哺乳動物miRNA之一，包含12個成員(let-7-a1、a2、a3、b、c、d、e、f1、f2、g、i和 miR-98)，定位于 8 個不同的同源染色體，12個成員有9個不同的let-7序列，但同為一個種子序列，其靶基因存在重疊。已經確認的let-7家族的靶基因包含有細胞周期調節子CDC25A、CDK6、caspase-3，癌基因 RAS、c-Myc，胚胎基因 HMGA2、Mlin-41、IMP-1等等[45]。Let-7發生突變的細胞不能進入正常的細胞周期，不能在正確的時間進行分化。肺癌組織中let-7的表達水平下調，且低表達let-7的患者生存期縮短，這提示let-7可能是一個腫瘤抑制基因。Chin等[46]發現，在非小細胞肺癌患者(74例)中，KRAS基因 3′端Let-7綁定位點的SNP等位基因變異頻率為18.1%～20.3%，而健康人群僅占5.8%。Motoyama等[47]使用real-time PCR技術分析了110個胃癌患者高遷移率組A蛋白(HMGA 2)的表達，發現HMGA2在胃癌組織中的表達遠遠高于正常組織，并且HMGA2的表達與漿膜侵犯、不良預后呈正相關，證明HMGA 2是胃癌的獨立預后因子，而let-7-a、let-7-b、let-7-c表達水平與HMGA 2的表達呈負相關，是HMGA2的負調節子。

3.4 miR-143及miR-145 miR-143和miR-145定位于染色5q33.1，被認為，是腫瘤抑制基因，與細胞分化關系密切。最初的研究認為miR-143與脂肪細胞分化有關，當脂肪細胞分化時，miR-143水平升高，當miR-143受抑制時，脂肪細胞的分化受抑，而遺傳物質和三酰甘油堆積，其機制可能與ERK5蛋白水平有關。在誘導細胞分化方面，Cordes等[48]證明，miR-143及miR-145在誘導多能干細胞向平滑肌細胞轉化中有重要促進作用。Northern免疫印跡分析表明，miR-143和miR-145在結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮內膜癌、淋巴瘤等細胞系中表達量明顯下調 。2009年，Suzuki等[49]發現，野生型 p53基因可以提高miR-143及miR-145轉錄后活性，而突變型p53基因則減少這些成熟miRNA的表達，進一步的實驗發現突變型的p53因為影響了Drosha復合體和p68，導致miRNA合成受抑。

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