人剪切修復基因XPD對肝癌細胞中p8/TTDA基因的調控作用*

杜芳騰，付 曉，張吉翔

(南昌大學第二附屬醫院消化科，江西330006)

核苷酸切除修復(NER)的機制聚集和調控了大概25種蛋白對損傷結構進行識別和切除，其中包括針對紫外線誘發的損傷。這一修復機制的中心成員是一種由10個亞基的轉錄/修復因子ⅡH(transcription/repair factorⅡH，TFⅡH)組成的復合體——正如名字暗示的那樣，除了具有修復DNA作用外，這一復合物還具有調節轉錄的作用。

目前發現，TFⅡH 復合物是由 10個亞基(XPB、XPD、p8/TTDA 、p62、p52、p44、p34、cdk7、cyclin H 和 MAT 1)組成的多酶復合物[1]。p8/TTDA是3種 TFⅡH修復基因(XPB、XPD和p8/TTDA)之一，被證實與一種稀少的光敏型遺傳早熟老化綜合征——毛發硫營養不良(TTD)相關，該綜合征的特點是毛發和指甲易碎，鱗狀皮膚和神經惡化[2]。

p8/TTDA是TFⅡH的第10亞基，在DNA修復中起著關鍵性的作用，它通過刺激XPB ATP依賴的單鏈DNA(ssDNA)解旋酶活性和激活損傷識別因子XPC-h HR23B，從而觸發DNA解旋。且熒光抗體標記還發現p8/TTDA可促進DNA解旋所需的XPA聚集至損傷位點處。在TTD-XPD細胞中p8/TTDA過表達可阻礙XPD突變所產生的有害作用，前者其主要是通過恢復TFⅡH表達水平起作用的。在TFⅡH復合物中，p8/TTDA與XPD、XPB共同在核苷酸切除修復功能中起著必不可少的作用[3-4]。

XPD是TFⅡH的第二大亞基。在核苷酸切除修復過程中，它負責從5′→3′方向打開受損位置的DNA雙鏈，從而允許損傷特異性核酸酶從兩側切下受損DNA，在轉錄過程中，XPD的作用是維持TFⅡH復合物的結構穩定，并促進轉錄活性的放大。它的功能受阻可導致突變的基因不能得到有效的修復，同時也會干擾一些調節細胞周期和細胞凋亡因子的功能，從而導致細胞正常生長和凋亡改變[5-6]。

因此，本研究用p EGFP-N2/XPD重組質粒穩定轉染人肝癌細胞SMMC-7721，檢測轉染前后對p8/TTDA表達情況的影響，探討它們之間的相互作用，并檢測其下游基因p53及cmyc等的表達;觀察轉染前后人肝癌細胞SMMC-7721所發生的生物學變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和質粒來源 人肝癌細胞SMMC-7721購自中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)。p EGFP-N2/XPD重組質粒由南昌大學第二附屬醫院分子醫學重點實驗室構建，通過用聚合酶鏈反應、酶切及基因測序三重鑒定所構建的克隆[7]。

1.1.2 主要試劑和產地 RPMI-1640購自美國Gibco BRL公司，FBS購自澳大利亞 Hyclone公司，Lipofectamine 2000TM、TrizolTM試劑購自美國Invetrogen公司。M-M LV Reverse Transcriptase、Rnasin、d NTP、Oligo(d T)15 購自美國Promega公司。PCR引物、G-418 Sulfate(進口分裝)購自上海生工生物工程有限公司，EndoFree Pladmid Kit、2 X Tag PCR MasterMix、Markr I購自北京天根生化科技有限公司。單克隆抗體XPD、p53、c-myc購自美國Santa Cruz公司，單克隆抗體p8購自美國Sigma公司，山羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶、山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶購自北京中杉金橋生物技術有限公司。MTT購自上海普飛生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 穩定轉染 傳代 24 h后，用重組質粒p EGFP-N 2/XPD、空載質粒p EGFP-N 2分別通過 Lipofectamine 2000轉染SM MC-7721細胞。以2×105細胞/孔的密度將SMMC-7721細胞平鋪于6孔板內，24 h細胞鋪90%，p EGFP-N2/XPD、pEGFP-N2每孔4.0μg，脂質體每孔10μL介導轉染。轉染48 h后用選擇培養基(含G-418800μg/m L)，經有限稀釋法篩選4周，獲得穩定轉染重組質粒p EGFP-N2/XPD的SMMC-7721細胞(SMMC-7721-p EGFP-N2/XPD)及穩定轉染空載質粒pEGFP-N 2的SMMC-7721細胞(SM MC-7721-p EGFP-N 2)。

1.2.2 實驗分組 實驗設4組，分別為穩定轉染重組質粒細胞組(SMMC-7721-p EGFP-N2/XPD)、穩定轉染空載質粒細胞組(SMMC-7721-p EGFP-N2)、脂質體轉染對照組、無轉染空白對照組。

1.2.3 RT-PCR檢測各組細胞基因表達量 使用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，合成 cDNA。應用 Primer Primier 5軟件設計引物 ，p8 正義:5′-CAA TGC CCT GGG GAA GAA G-3′，反義:5′-TAA TTC ACC CAC TCG C TC C-3′，擴增片段長度 103 bp;XPD正義:5′-TCT GCC TCT GCC CTA TGA T-3′，反義:5′-CGA TTC CCT CGG ACA CT T T-3′，擴增片段長度 363 bp;p53 正義:5′-TTG AGG TGC GTG TTT GTG-3′，反義 :5′-T TT ATG GCG GGA GGT AGA-3′，擴 增片 段長 度335 bp，c-myc 正義:5′-AAC CCT TGC GCA TCC AC-3′，反義:5′-CCT CCT CGT CGC AGT AGA AA-3′，擴增片段長度317 bp;β-actin 正義 :5′-CTT CC T GGG CAT GGA GTC-3′，反義:5′-GCC GAT CCA CAC GGA GTA-3′，擴增 片段長度 232 bp。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳(含5μg/L溴化乙錠)后，在紫外燈下觀察結果。并通過FR200圖像分析軟件(上海復日公司)觀察目的電泳條帶的斑點密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組的 p8、XPD、p53、c-myc條帶的密度掃描值，獲得其相對表達量，并進行統計學分析。

1.2.4 Western blot法檢測各組細胞蛋白表達量 使用總蛋白提取試劑盒分別提取4組細胞的總蛋白，使用全自動生化分析儀(Beckman，USA)測定蛋白濃度。取同量蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳，繼而轉移蛋白于硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，分別先后加入一抗和二抗孵育，BeyoECL Plus熒光檢測試劑顯色。經曝光、顯影、定影后照相，通過FR200圖像分析軟件讀取目的電泳蛋白的斑點密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組的 p8、XPD、p53、c-myc條帶的密度掃描值，測得其相對表達量，并進行統計學分析。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽(M TT)法觀察細胞增殖活力 使用0.25%胰淀粉酶消化收集細胞，每組細胞以104細胞/孔濃度平鋪于96孔培養板中，每組6孔，常規培養48 h后吸出培養基，每孔加入5 mg/L MT T 20μL，繼續培養4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150μL，振蕩10 min。使用酶標儀(Labststems，芬蘭)測定492 nm各孔吸光度(A)值，取每孔平均值，計算細胞抑制率，以間接反映各組活細胞數量。

1.3 統計學處理 應用SPSS12.0統計軟件進行統計分析，數據以表示，組間比較采用方差分析。

2 結 果

2.1 各組細胞 p8、XPD、p53、c-myc m RNAs的表達情況RT-PCR檢測結果顯示:穩定轉染重組質粒細胞組、穩定轉染空載質粒細胞組、脂質體轉染對照組和無轉染空白對照組中p8/TTDA m RNA相對表達量分別為:0.624±0.055、0.179±0.084、0.159±0.093、0.156±0.060。4組細胞中XPD m RNA相對表達量為:0.972±0.078、0.295±0.040、0.219±0.072、0.280±0.081。4組細胞中p53 m RNA相對表達量為:0.829±0.023、0.567±0.018、0.566±0.052、0.516±0.064;4 組細胞中c-myc m RNA相對表達量為:0.212±0.027、0.862±0.013、0.887±0.067、0.816±0.069。p8 m RNA 在人肝癌細胞SMMC-7721是低表達的，穩定轉染野生型XPD后，p8 m RNA和XPD m RNA表達量明顯增高(P＜0.001)。穩定轉染重組質粒細胞組p53 m RNA表達量亦明顯增高(P＜0.05)，cmyc m RNA表達量則明顯下降(P＜0.001)。而p8、XPD、p53、c-myc m RNAs表達量在穩定轉染空載質粒細胞組、脂質體轉染對照組及無轉染空白對照組之間差異均無統計學意義(P＞0.1)，見圖 1。

圖1 4組細胞中p8、XPD、p53、c-myc m RNAs的表達情況

2.2 各組細胞p8、XPD、p53、c-myc蛋白的表達情況 Western blot法檢測結果顯示:p8蛋白在4組細胞中的相對表達量分別為:0.516±0.093、0.257±0.086、0.287±0.044、0.252±0.084;XPD蛋白相對表達量分別為:0.606±0.076、0.264±0.083、0.223±0.086、0.276±0.053;p53蛋白相對表達量分別為:0.894±0.046、0.455±0.038、0.443±0.051、0.405±0.072;c-myc蛋白相對表達量分別為:0.233±0.040、0.529±0.067、0.500±0.052、0.521±0.062。p8蛋白在人肝癌細胞SM MC-7721是低表達的。穩定轉染野生型XPD后，p8蛋白、XPD蛋白、p53蛋白表達量明顯增高(P＜0.05)，c-myc蛋白表達量則明顯下降，差異有統計學意義(P＜0.001)。而在穩定轉染空載質粒細胞組、脂質體轉染對照組及無轉染空白對照組之間差異均無統計學意義(P＞0.1)。各分子蛋白表達水平的變化趨勢與其m RNA變化趨勢相一致，見圖2。

圖2 4組細胞中p8、XPD、p53、c-myc蛋白的表達情況

2.3 各組細胞增殖活力的變化情況 M TT檢測顯示:以無轉染空白對照組生長率為1，脂質體轉染對照組為 1.014±0.025，穩定轉染空載質粒組為 0、981±0、042，穩定轉染重組質粒細胞組為0、616±0、055，穩定轉染重組質粒細胞細胞組的吸光度與其他兩組比較明顯下降，差異有統計學意義(P＜0.001);穩定轉染空載質粒細胞組、脂質體轉染對照組與無轉染空白對照組之間相互比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討 論

DNA修復是保持人類基因組完整性的核心，DNA修復能力的減低常易發生癌變，而機體常暴露于各種有害內外物質中，致使DNA的結構受損，導致生命體重要的遺傳信息的丟失。為維持基因組穩定性和完整性，可促使充足的DNA修復基因表達，通過多種途徑(如核酸切除修復、同源重組修復、非同源重組修復、堿基切除修復和錯配修復等)促使各種損傷得到有效修復。其中核酸切除修復是最多樣和最普遍的DNA修復機制，而TFⅡH則在核苷酸切除修復功能中發揮著重要作用。XPB、p8/TTDA、p62、p52、p44和 p34組成一個核心亞復合物，cdk7、cyclin H和MAT 1組成一個具有CDK活化的激酶(CAK)亞復合物，而XPD則作為一個支架，介導著CAK亞復合物與核心亞復合物的結合。XPD以N-末端與M AT1的卷曲結構域連接，同時以C-末端與p44亞基的N-末端相連，從而把cdk7以及整個CAK亞復合物錨定在核心復合物上，這就形成了 TFⅡH多酶復合物。XPD、XPB、p8/T TDA則是TFⅡH中的3種起修復作用的基因[3]。

有研究證實，XPD除了在TFⅡH介導的核酸切除修復和轉錄過程中發揮主要作用外，還參與了細胞的增殖、凋亡，腫瘤的發生甚至化療藥物抗藥性的產生等多種生理及病理機制[6]。因此，有理由認為，XPD基因表達下降則有利于腫瘤的發生、發展。本研究亦發現，在人肝癌細胞SM MC-7721中p8和XPD m RNAs和蛋白均為低表達。現今，有研究者發現在TTD-XPD細胞中p8/TTDA過表達可阻礙XPD突變所產生的有害作用[2]。故本研究使用重組質粒p EGFP-N2/XPD轉染SMMC-7721細胞，從而研究人剪切修復基因XPD對p8/TTDA基因的影響。結果證實，轉染野生型XPD后，p8 m RNA和蛋白表達量均明顯增高。

Giglia-Mari等[7]通過綠色熒光蛋白(GFP)標記 TTDA和XPD亞基，并利用高分辨率的共聚焦顯微鏡進行觀察。結果發現T TDA-GFP與XPD-GFP穩定地組成TFⅡH并且參與DNA修復，而且與僅定位于細胞核內的XPB亞基相比，在細胞質和細胞核中都可以觀察到 TTDA-GFP和 XPD-GFP。還通過光脫色熒光恢復技術(FRAP)得出結論，在核心的TFⅡH復合體吸附到DNA損傷處后，一旦T TDA進入到正確的位置，將會引起構象上的改變來召集其他一些用于修復的亞基。TTDA也可幫助TFⅡH正確折疊，防止它的降解和積累 TFⅡH到達一種進行核苷酸切除修復功能所需的水平。本研究發現轉染野生型XPD基因增加了SMMC-7721細胞生長的抑制率，并導致穩定轉染重組質粒細胞進入S期出現障礙，停滯在G1期的細胞增多，抑制了癌細胞的增殖，促進了癌細胞的凋亡。p8基因和蛋白表達水平增高，可促進恢復TFⅡH表達水平，從而有助于抑制癌細胞生長。

抑癌基因p53可通過抑制細胞周期、促進細胞凋亡、穩定染色體基因組及抑制血管生成等途徑來防止細胞惡變，抑制腫瘤生長。有研究認為，p53參與調節核酸切除修復途徑，p53 C-末端釋放的多肽可與XPB相互作用從而增加p53促凋亡活性;同時p53 C-末端也可抑制TFⅡH復合物的解旋酶活性。當DNA受到損傷時，XPB和XPD可識別損傷部位并與p53結合，促使損傷部位得到修復或誘導細胞凋亡[8]。本實驗亦發現，在SMM C-7721-p EGFP-N 2/XPD組中p53 m RNA和蛋白表達量明顯增高。野生型XPD轉染后可上調p53，而p53又可與XPB相互作用，促進癌細胞凋亡。所以，作者認為XPD可能在TFⅡH復合物中發揮著核心調節作用，但尚需進一步研究證實。

癌基因c-myc可以促進細胞的生長與增殖，阻斷細胞分化，促使腫瘤形成。有研究認為，XPD可以通過Fuse結合蛋白(FBP)影響c-myc的表達;FBP有潛在的轉錄活化和抑制功能，是c-myc表達所必需的;且當XPD發生缺陷或突變時cmyc表達量常增加;將FBP或(和)XPD轉入進XPD缺陷的細胞后c-myc表達量可下降[9]。本實驗亦證實轉染野生型XPD后，c-myc m RNA和蛋白表達量均明顯降低。c-myc表達的下降，可引起癌細胞的生長力降低和細胞凋亡增加[10]。

本實驗表明，人剪切修復基因XPD可調控p8/TTDA基因的表達。野生型 XPD穩定轉染SMM C-7721細胞后，p8 m RNA和蛋白表達量明顯增高。p8基因和蛋白表達量水平增高，可促進恢復TFⅡH表達水平，抑制癌細胞的無限增殖。野生型XPD轉染后亦可上調p53基因及蛋白表達，而p53又可與XPB相互作用，促進癌細胞凋亡。轉染后，c-myc表達下降，可引起癌細胞的增殖降低和細胞凋亡增加。本實驗對XPD基因抑制肝癌細胞生長的分子途徑進行了初步探討，為肝癌的基因治療提供了分子水平的實驗依據，并大膽猜測XPD基因在TFⅡH復合物中可能發揮著核心調節作用，其具體調節作用機制還有待于進一步研究探索。

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