豬附紅細胞體PCR與光鏡檢測方法的比較研究

謝建中

附紅細胞體病是由附紅細胞體寄生在人或多種動物紅細胞表面、血漿和骨髓而引起的一種人獸共患病，Doyle首次在印度發現豬附紅細胞體并歸入立克次氏體[1],但近年根據16S rRNA基因序列分析將其歸為支原體屬（Mycoplasma)[2-3],2002年Nemark等[4]將該病原體更名為 Mycoplasma suis（M.suis）,現分類作為支原體屬的單個新種，近年來該病在全國呈暴發流行趨勢，引起廣大醫學和畜牧工作者的注意。

目前臨床上對該病的診斷尤為重視，本研究對鮮血壓片、姬姆薩染色、吖啶橙染色以及PCR法4種診斷方法進行臨床比較，以期找到更為科學準確的診斷手段。

1 材料和方法

1.1 待測血樣

血樣來源于獸醫門診具有豬附紅細胞體病臨床癥狀的疑似病例豬體。

1.2 鮮血壓片和姬姆薩染色

鮮血壓片檢查以血漿中和紅細胞表面見到多形淡綠色小體為陽性。姬姆薩染色采用改進方法，包括血液推片，火焰固定，加溫染色0.5 min，自然染色5 min，以油鏡觀察紅細胞上出現青紫色小體為陽性。

1.3 吖啶橙染色

具體染色方法是將涂有標本的涂片用95%乙醇固定標本15～30 min，用濾紙吸去載玻片上的殘液，用1%醋酸酸化30 s，用 PBS清洗 1 min，加 0.01%吖啶橙染液染色1～5 min，用 PBS清洗1 min，加0.1mol/l CaCl2分化30 s～2 min，用PBS清洗3次，每次數秒，熒光顯微鏡觀察，以紅細胞邊緣上出現淡綠色熒光為陽性。

1.4 豬附紅細胞體DNA基因提取

取400 μlACD抗凝血加入1.5 mlEP管中，加入200 μl裂解液（100 mmol Tris,10.0 mmol EDTA,1.0 mol NaCl,pH 值 7.4）,再加入 8 μl蛋白酶 K(20mg/ml)和100 μl 10%SDS溶液56℃水浴3 h。于100℃ 10 min滅活蛋白酶K，加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25： 24： 1）抽提兩次，4℃離心15 000 g 10 min。加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提1次，4℃離心15 000 g 10 min。取上清液加入兩倍體積的無水乙醇和1/10體積的2 mol/l的NaAc，-70℃沉淀30 min,4℃離心15 000 g 30 min。用70%的無水乙醇漂洗1次，自然干燥，用30 μl的ddH2O溶解，-20℃保存備用。

1.5 引物設計與合成

根據Genbank中的豬附紅細胞體新基因組序列（AJ504999），利用Primer5.0設計1對特異性引物：

F1 5'CAGCGGTGAGAAAGCAAG 3'

F2 5'CTGGGTGTATGAAGAGTGGTGT 3'。

引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，擴增的目的片段為603 bp。

1.6 PCR反應體系及反應程序

對樣本DNA用上述引物在TECHNE,TC 512基因擴增儀上進行PCR擴增。50 μl反應體系如下：DNA Taq聚合酶1.25 U，10×PCR Buffer（Mg2+Free）5 μl，dNTP Mixture（各 2.5 mmol/l）4 μl，MgCl2（25 mmol/l）2.5 μl，模板 DNA 2 μl，引物（20 μmol/l）各 1 μl，加滅菌蒸餾水至50 μl。反應程序如下：預變性95℃5 min；（變性94℃ 50 s，退火56℃ 50 s，延伸 72℃ 50 s）×35個循環；終末延伸72℃10 min。

1.7 特異性試驗

用F1和F2為引物，以多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、弓形蟲、牛巴貝斯蟲、豬圓環病毒的基因組、血液基因組DNA作為特異性試驗的模板進行PCR擴增。

1.8 敏感性試驗

提取豬附紅細胞體血液基因組DNA，測定其OD260nm值，并進行10倍稀釋，用F1和F2為引物進行擴增，確定PCR方法敏感性。

1.9 臨床樣本檢測試驗

對臨床20例疑似病例分別利用鮮血壓片、姬姆薩染色、吖啶橙染液染色和PCR方法檢測，確定陽性檢出率。

2 結果

2.1 PCR特異性反應試驗結果（見圖1）

圖1 特異性試驗結果

結果表明，只有豬附紅細胞體擴增出特異性條帶，其他病原體未見條帶。

2.2 PCR反應敏感性試驗結果

試驗結果表明，能檢測到的血液基因組DNA最高敏感度為0.65 ng。

2.3 20例臨床樣品的檢測結果（見圖2）

鮮血壓片、姬姆薩染色、吖啶橙染色及PCR檢出率分別為20%、35%、50%、70%，PCR擴增結果如圖2。

圖2 臨床樣品檢測結果

3 討論

從試驗檢測結果可以看出，PCR方法(70%)）的檢出率最高，而吖啶橙染色（50%）、姬姆薩染色（35%）和鮮血壓片（20%）的陽性檢出率較低，有力的證實了PCR方法比其他診斷方法在檢測豬附紅細胞體方面更加科學準確。

本試驗研究表明，從臨床癥狀疑似的病例PCR診斷結果并不一定是豬附紅細胞體病，因此，憑借臨床癥狀診斷存在較大缺陷，另外光鏡檢查存在假陽性率較高，許多原因造成紅細胞變形，如染色劑附著在紅細胞上，貧血會造成棘形、鋸齒形紅細胞增多，尤其當紅細胞表面附紅細胞體數量少，或由于貧血等原因而導致血片中有大量的變形紅細胞和紅細胞碎片時，很難與紅細胞中出現的一些嗜堿性物質，如帕彭海姆體(Pappenheimer bodies)、海因茨體(Heinz bodies)和豪厄爾一若利小體(Howell-Jolly bodies)相區別[5]，影響了檢測結果，PCR技術具有快速、靈敏、特異性強等一系列優點，它能大量擴增低拷貝甚至單拷貝基因序列，很容易被瓊脂糖凝膠電泳檢測[6]，許多輕微差別的疾病診斷也可通過PCR方法在短時間內得到結論，本試驗基于血液基因組設計引物建立的PCR診斷方法有較高診斷特異性，DNA最低檢測量為0.65 ng，同時可以和其他相關的豬病原體進行區別診斷，保證了檢測結果的準確性，憑借PCR診斷方法的自身優勢可以成為臨床診斷豬附紅細胞體病的一種必要手段，值得在臨床上推廣應用。

[1]Doyle L P.A rickettsia-like or anaplasmosis-like disease in swine[J].J.Am.Vet.Med.Ass.,1932（8）:668-671.

[2]Neimark H,Johansson K E,Rikihisa Y,et al.Proposal to transfer some members of the genera Haemobartonella and Eperythrozoon to the genus Mycoplasma with descriptions of'Candidatus Mycoplasma haemofelis','Candidatus Mycoplasma haemomuris''Candidatus Mycoplasma haemosuis'and'Candidatus Mycoplasma wenyonii'[J].Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2001,51(3):891-899.

[3]Messick JB,WalkerP G,RaphaelW,etal.'Candidatus Mycoplasma haemodidelphidis′sp.nov., 'Can- didatus Mycoplasma haemolamae′sp.nov.and Mycop lasma haemocanis comb.nov.,haemotrophic parasites from a naturally infected opossum (Didelphis virginiana),alpaca (Lama pacos)and dog(Canis familiaris) : phylogenetic and secondary structural relatedness of their 16S rRNA gene to other mycoplasmas[J].Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2002,52:693-698.

[4]Neimark H,K.E.Johansson,Y.Rikihisa,et al.Revision of haemotrophic Mycoplasma species names[J].Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2002,52:683.

[5]Messiek J B,Smith G,Berent L,et al.Genome size of Eperythrozoon suis and Hybridization with 16S rRNA gene[J].Can.J.M.icrobiol.,2000,46:1082-1086.

[6]Hoelzle L E,Adelt D,Hoelzle K,et al.Development of a diagnostic PCR assay based on novel DNA sequences for the detection of Mycoplasma suis（Eperythrozoon suis)in porcine blood[J].Vet Microbiol.,2003,93(3):185-196.