犬瘟熱病毒小熊貓株核蛋白和融合蛋白基因克隆及序列分析

鞠會(huì)艷，喬 軍，高玉偉，楊松濤，夏咸柱*

（1.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部，長(zhǎng)春 130062；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130062；3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

犬瘟熱病毒（Canine Distemper Virus，CDV）傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，呈世界性分布，易感宿主范圍廣，自然條件下，CDV感染犬、大熊貓、小熊貓、獅、虎和豹等食肉目所有8個(gè)科、偶蹄目豬科、靈長(zhǎng)目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動(dòng)物，嚴(yán)重危害了我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)和珍稀野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)[1]。犬瘟熱是危害國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物-小熊貓（Ailurus fulgens）的最大疾病。小熊貓作為浣熊科動(dòng)物，對(duì)CDV非常敏感，自然感染CDV的病例時(shí)有發(fā)生，甚至死亡[2-4]。本文用的CDV LP株是本研究室從死亡小熊貓肝臟病料中分離并鑒定的一株犬瘟熱病毒。人工接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該毒株能誘導(dǎo)幼犬產(chǎn)生高效價(jià)的中和抗體，表明CDV LP株是具有很強(qiáng)免疫原性的毒株。在CDV結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白是保守性較強(qiáng)的免疫原性蛋白，而且，N蛋白除含有B細(xì)胞表位外，還含有T細(xì)胞表位，在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要作用[5-8]。F蛋白是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要表面糖蛋白，F(xiàn)蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情況下抑制癥狀的發(fā)生[9]。鑒于N蛋白和F蛋白在CDV結(jié)構(gòu)蛋白中的重要地位，本試驗(yàn)對(duì)這兩種結(jié)構(gòu)蛋白基因進(jìn)行了克隆、測(cè)序和序列分析，旨在了解該毒株的分子生物學(xué)背景，為進(jìn)一步研究安全有效的CDV基因疫苗和重組活載體疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞與菌株

犬瘟熱病毒小熊貓株（CDV LP）是本實(shí)驗(yàn)室用犬腎傳代細(xì)胞從某動(dòng)物園死亡的小熊貓肝臟中分離得到的；犬腎傳代細(xì)胞（MDCK）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；E.coli JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

經(jīng)典總RNA提取試劑盒和Taq plus DNA聚合酶（購(gòu)自上海生物工程公司）；反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）、反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（RNase Inhibitor）、T4DNA連接酶及dNTP（購(gòu)自NEB生物公司）；DNA凝膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）（購(gòu)自 Vitagene公司）；MEM培養(yǎng)基（為GlBCO產(chǎn)品）；Random和Oligod（T）引物、無(wú)RNase的DEPC水、pMD18-T載體，各種限制性內(nèi)切酶和DL 15000+2000的DNA Marker（購(gòu)自TakaRa生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 CDV的細(xì)胞培養(yǎng)

CDV LP株用MDCK細(xì)胞培養(yǎng)，生長(zhǎng)液為含8%犢牛血清的MEM培養(yǎng)液，維持液為含2%犢牛血清的MEM培養(yǎng)液。在細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)接毒，待70%細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE時(shí)收毒。將收毒的細(xì)胞瓶反復(fù)凍融3次，倒出CDV培養(yǎng)液，5 000 r·min-1離心10 min，取上清作為提取總RNA的材料。

1.2.2 DNA操作技術(shù)

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、外源DNA片段與載體的連接反應(yīng)、連接物的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA的小量制備（堿裂解法）、DNA瓊脂糖凝膠電泳、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)及目的DNA片段的回收皆按照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行。

1.2.3 CDV LP株N和F蛋白基因的克隆和測(cè)序

1.2.3.1 引物的設(shè)計(jì)

參考GenBank中報(bào)道的CDV Onderstepoort株和A75/17株N和F蛋白基因序列，按照引物的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)了以下兩對(duì)特異性引物，分別用于CDV LP株N和F蛋白基因的擴(kuò)增。其中，P1和P2用于N蛋白基因的擴(kuò)增，P3和P4用于F蛋白基因的擴(kuò)增。為方便下一步克隆，分別在上、下游引物中引入Eco RⅠ（GAATTC）和 NotⅠ（GCGGCCGC）酶切位點(diǎn)。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

N基因上游引物 P1：5′GAATTCAATATGGCT AGCCTTCTTAAGAGCCTC 3′；

N基因下游引物 P2：5′GCGGCCGCTTAATTG AGTAGCTCTCTATCATTG 3′；

F 基因上游引物 P3：5′GAATTCACCATGGAC AACAAAATCCCCAAAATAT 3′；

F 基因下游引物 P4：5′GCGGCCGCTTAGAGT GATCTTACATAGGATTTC 3′。

1.2.3.2 總RNA的提取

利用經(jīng)典總RNA抽提試劑盒從反復(fù)凍融的CDV細(xì)胞培養(yǎng)液中直接提取總RNA。具體操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3.3 RT反應(yīng)

在20 μL反應(yīng)體系中分別加入提取的細(xì)胞總RNA 2 μL，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液 4 μL，2.5 mmol·L-1的dNTP 4 μL，RNase Inhibitor（40 U·μL-1） 0.5 μL，10 U·μL-1的 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，Oligo d（T）（10 pmol·μL-1）1 μL，6 μL 的無(wú) RNase 的 DEPC 水，將此20 μL反應(yīng)體系中的各組分分別加到1.5 mL滅菌的Eppendorf管中，瞬間離心后，于42℃水浴中反應(yīng) 1～1.5 h。

1.2.3.4 PCR擴(kuò)增

在50 μL PCR反應(yīng)體系中分別加入10×PCR反應(yīng)緩沖液 5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 4 μL，上游引物（25 pmol·μL-1）1 μL，下游引物（25 pmol·μL-1）1 μL，RT產(chǎn)物5 μL，Taq plus DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.3 μL，補(bǔ)加ddH2O至50 μL。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確定了N和F基因的最佳PCR擴(kuò)增參數(shù)。N基因的擴(kuò)增條件是：96℃預(yù)變性200 s，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸120 s；均為33個(gè)循環(huán)，最后，72℃再延伸10 min；F基因的擴(kuò)增條件是：96℃預(yù)變性200 s，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸150 s。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3.5 N和F蛋白基因的克隆

分別取經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增所得的CDV LP株N和F蛋白基因的DNA回收片段4.5 μL，加連接液5 μL、pMD18-T 載體 0.5 μL，16 ℃連接 1 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，然后按常規(guī)方法涂在含適量氨芐青霉素的LB瓊脂平板（轉(zhuǎn)化前在平板的瓊脂表面加200 mg·mL-1的IPTG 4 μL和20 mg·mL-1的 X-gal 40 μL，涂勻，37 ℃放置 3 h）上培養(yǎng)12 h左右，挑選白色菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pMD18-N和pMD18-F。然后用各種限制性內(nèi)切酶酶切鑒定及以挑選的質(zhì)粒為模板按上述的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)酶切和PCR鑒定篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

1.2.3.6 N和F蛋白基因的測(cè)序分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pMD18-N和pMD18-F各挑取1個(gè)陽(yáng)性克隆送到上海聯(lián)合基因生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。用DNASIS和DNAstar軟件對(duì)測(cè)定的N和F基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，并與國(guó)內(nèi)外不同的CDV分離株相應(yīng)的基因序列進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 N蛋白基因的擴(kuò)增、克隆及重組質(zhì)粒pMD18-N的鑒定

用含Eco RⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)的N基因引物P1和P2，利用RT-PCR方法從犬瘟熱病毒中擴(kuò)增的N基因產(chǎn)物大小為1 571 bp，與理論值相符（見(jiàn)圖1）。將N基因PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，克隆得到重組質(zhì)粒pMD18-N。該重組質(zhì)粒經(jīng)Eco RⅠ和NotⅠ雙酶切得到2 660和1 571 bp兩個(gè)片段，其中1 571 bp片段即為N基因片段；經(jīng)Eco RⅠ酶切得到4 231 bp大小的線性化片段；PstⅠ酶切得到3 690和541 bp兩個(gè)片段；BglⅡ酶切得到3 331和900 bp兩個(gè)片段；KpnⅠ酶切得到4 231 bp大小的線性化片段（見(jiàn)圖2）。以重組質(zhì)粒pMD 18-N為模板，用N基因引物按PCR方法擴(kuò)增可得到與目的基因-N基因大小一致的片段（見(jiàn)圖3）。酶切和PCR鑒定證明N基因已正確克隆到T載體中。

圖1 N基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR production of N gene

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-N的酶切鑒定Fig.2 Identification of pMD18-N by restriction endonuclease digestion

圖3 重組質(zhì)粒pMD18-N的PCR鑒定Fig.3 Identification of pMD18-N by PCR

2.2 F蛋白基因的擴(kuò)增、克隆及重組質(zhì)粒pMD18-F的鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明CDV LP株F基因RT-PCR產(chǎn)物大小約為2 000 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（見(jiàn)圖4）。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，克隆得到重組質(zhì)粒pMD18-F。該重組質(zhì)粒經(jīng)Eco RⅠ和NotⅠ雙酶切得到2 660和2 000 bp兩個(gè)片段，其中2 000 bp片段即為F基因片段；經(jīng)NotⅠ酶切得到4 660 bp大小的線性化片段；KpnⅠ酶切也得到4 660 bp大小的線性化片段（見(jiàn)圖5）。以重組質(zhì)粒pMD18-F為模板，用F基因引物按PCR方法擴(kuò)增可得到與目的基因F基因大小一致的片段（見(jiàn)圖6）。酶切和PCR鑒定證明F基因已正確克隆到T載體中。

圖4 F基因的PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR production of F gene

圖5 重組質(zhì)粒pMD18-F的酶切鑒定Fig.5 Identification of pMD18-F by restrictionendonuclease digestion

圖6 重組質(zhì)粒pMD18-F的PCR鑒定Fig.6 Identification of pMD18-F by PCR

2.3 N蛋白基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列分析

2.3.1 N蛋白基因序列測(cè)定結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列經(jīng)序列測(cè)定表明，CDV LP株N蛋白基因全長(zhǎng)1 571 bp，編碼523個(gè)氨基酸，與Onderstepoort弱毒株和A75/17強(qiáng)毒株N蛋白大小相同。從推導(dǎo)的N蛋白氨基酸序列比較結(jié)果可以看出，野毒株和弱毒株差異主要在N端和C端。CDV LP株N蛋白氨基酸序列與其它野毒株一樣可分為三個(gè)區(qū)，即N端可變區(qū)（17-159位氨基酸殘基）、C端可變區(qū)（408-519位氨基酸殘基）和中間的高度保守區(qū)（160-407位氨基酸殘基）。有研究表明，在所有的麻疹病毒屬成員中N蛋白中間區(qū)域都是保守的，因?yàn)樗蠳蛋白與RNA相互作用、病毒RNA的核衣殼化以及核衣殼的包裝等必需的信息，這個(gè)區(qū)域的任何變化都有可能導(dǎo)致病毒包裝不完全，而使病毒死亡。另外，在CDVLP株N蛋白N端281-289位上存在Y-P-A-L-G-L-H-E-F 9肽的序列，推測(cè)它可能是誘導(dǎo)CTL活性的靶蛋白的抗原表位之一。用BioEdit軟件對(duì)推導(dǎo)的CDV LP株N蛋白氨基酸組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)亮氨酸（Leu）占所有氨基酸殘基的 9.54%（50/523）；絲氨酸（Ser）占 9.35%（49/523）；異亮氨酸（Ile）占 8.78%（46/523），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他氨基酸所占比例。氨基酸組成分析結(jié)果提示N蛋白具有易折疊的分子結(jié)構(gòu)。

2.3.2 CDV不同毒株N基因同源性分析

結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 CDV不同毒株N基因同源性分析Fig.7 Identities of N genes among different strains of CDV

基于CDV N基因的聚類結(jié)果表明，CDV LP株與A75-17、TN、5804和5804P等強(qiáng)毒株的親緣關(guān)系要比Onderstepoort弱毒株更近（見(jiàn)圖7）。通過(guò)序列比較，發(fā)現(xiàn)N蛋白具有高度的保守性，我們分析其原因，可能是由于CDV H和F蛋白位于病毒的表面，直接與免疫系統(tǒng)相接觸，受到免疫系統(tǒng)的壓力更大，為了在體內(nèi)生存不得不發(fā)生較快的變異；而作為N蛋白，其主要功能是在病毒裝配、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程中起調(diào)控作用，發(fā)生較大的變異則不利于病毒的增殖；即使N基因發(fā)生了突變，在大多數(shù)情況下也是同義突變，其氨基酸序列也不會(huì)發(fā)生改變。

2.4 F蛋白基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列分析

2.4.1 F蛋白基因序列測(cè)定結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列分析

經(jīng)序列測(cè)定表明，CDV LP株F蛋白基因全長(zhǎng)1 989 bp，編碼662個(gè)氨基酸，與Onderstepoort弱毒株F蛋白大小相同。CDV LP株F蛋白含有17個(gè)半胱氨酸殘基，而Onderstepoort弱毒株含有16個(gè)半胱氨酸殘基。Onderstepoort弱毒株F蛋白含有4個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，而CDV LP野毒株推導(dǎo)的F蛋白氨基酸序列中則含有5個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，分別位于62-64、108-110、141-143、173-175、179-181位氨基酸，其中108-110位氨基酸殘基上所形成的潛在糖基化位點(diǎn)是CDV LP野毒株擁有而Onderstepoort弱毒株所沒(méi)有的。另外，通過(guò)對(duì)副粘病毒F蛋白基因轉(zhuǎn)錄研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)基因mRNA翻譯的最初產(chǎn)物是F0蛋白，在蛋白水解酶的作用下，裂解為F1和F2兩個(gè)亞單位，二者再通過(guò)二硫鍵連接成蛋白二聚體。通過(guò)分析F1亞單位N末端氨基酸序列已經(jīng)確認(rèn)了CDV LP株F0蛋白的裂解位點(diǎn)位于220-224氨基酸殘基部位。用TMHMM軟件分析還發(fā)現(xiàn)，在F蛋白中還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)跨膜區(qū)，分別位于225-247和606-628位氨基酸殘基處。

2.4.2 CDV不同毒株F基因同源性分析

結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 CDV不同毒株F基因同源性分析Fig.8 Identities of F genes among different strains of CDV

與GenBank中已發(fā)表的15個(gè)CDV毒株相比，CDV LP株F基因核苷酸的同源性在90.2%～100.0%；推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性在91.0%～100.0%之間（見(jiàn)圖8）。CDV LP株與19876野毒株的親緣關(guān)系較近，而與弱毒株Onderstepoort株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；Onderstepoort株是30年代從北美養(yǎng)狐農(nóng)場(chǎng)分離出來(lái)，后經(jīng)雪貂傳代，又經(jīng)數(shù)代雞胚傳代后的標(biāo)準(zhǔn)弱毒株，而19876野毒株則是最近從發(fā)病水貂腦中分離出來(lái)的一株強(qiáng)毒株。聚類分析提示，CDV LP株是一株與CDV強(qiáng)毒株親源關(guān)系很近的毒株。

2.5 N和F蛋白疏水性、抗原表位和表面極性預(yù)測(cè)分析

用 DNAStar軟件對(duì) Onderstepoort弱毒株和CDV LP株N蛋白和F蛋白進(jìn)行了疏水性及抗原表位預(yù)測(cè)比較分析。通過(guò)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)CDV LP毒株推導(dǎo)的N蛋白和F蛋白在疏水性、Jameson-Wolf抗原表位方面與標(biāo)準(zhǔn)弱毒株Onderstepoort株有一定的差異（見(jiàn)圖9）。與Onderstepoort弱毒株相比，CDV LP野毒株N蛋白在475-485位氨基酸處有明顯Jameson-Wolf抗原表位優(yōu)勢(shì)，CDV LP野毒株F蛋白在105-115位和365-375位氨基酸處有明顯Jameson-Wolf抗原表位優(yōu)勢(shì)（見(jiàn)箭頭所示）。這種抗原表位差異提示，CDV LP株N蛋白和F蛋白的免疫原性可能要優(yōu)于Onderstepoort弱毒株。

圖9 DNAStar軟件對(duì)推導(dǎo)的Onderstepoort弱毒株和CDV LP株N和F蛋白疏水性、抗原表位及表面極性預(yù)測(cè)Fig.9 Analysis of hydrophobicity,antigenic index and surface probability of N and F protein of Onderstepoort and CDV LP strain

3 討 論

3.1 CDV LP株N蛋白基因和F蛋白基因序列分析

為探究犬瘟熱病毒小熊貓株（CDV LP株）N和F蛋白基因是否適合作為深入研究CDV基因疫苗和重組活載體疫苗的目的基因，本研究對(duì)CDV LP株核蛋白（N）和融合蛋白（F）兩種主要結(jié)構(gòu)蛋白基因進(jìn)行了克隆、測(cè)序及序列分析。CDV LP株N蛋白基因全長(zhǎng)1 571 bp，編碼523個(gè)氨基酸，與Onderstepoort弱毒株和A75/17強(qiáng)毒株的N蛋白大小相同。在CDV LP株N蛋白N端281-289位上存在Y-P-A-L-G-L-H-E-F 9肽的序列，推測(cè)它可能是誘導(dǎo)CTL活性的靶蛋白的抗原表位之一。CDV N基因的聚類分析表明，CDV LP株與A75-17、TN、5804和5804P等強(qiáng)毒株的親緣關(guān)系要比Onderstepoort弱毒株更近。通過(guò)序列比較發(fā)現(xiàn)N蛋白具有高度的保守性，這可能是因?yàn)镹蛋白的主要功能是在病毒裝配、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程中起調(diào)控作用，發(fā)生較大的變異則不利于病毒的增殖[11]。即使N基因發(fā)生了突變，在大多數(shù)情況下也是同義突變，其氨基酸序列也不會(huì)發(fā)生改變。

CDV LP株F蛋白基因全長(zhǎng)為1 989 bp，編碼662個(gè)氨基酸，與Onderstepoort弱毒株F蛋白大小相同。CDV LP野毒株推導(dǎo)的F蛋白氨基酸序列中含有5個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，而Onderstepoort弱毒株F蛋白則含有4個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，CDV LP株108-110位氨基酸殘基上所形成的潛在糖基化位點(diǎn)是Onderstepoort弱毒株所沒(méi)有的。糖基化位點(diǎn)的不同可能影響病毒的抗原性，CDV LP株比Onderstepoort弱毒株多一個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，預(yù)示著CDV LP株的抗原性可能優(yōu)于Onderstepoort弱毒株。聚類分析提示，CDV LP株是一株與CDV強(qiáng)毒株親源關(guān)系很近的毒株。

DNAstar軟件對(duì)CDV LP和Onderstepoort弱毒株N蛋白和F蛋白進(jìn)行的疏水性及抗原表位預(yù)測(cè)分析表明CDV LP野毒株與Onderstepoort弱毒株相比F蛋白在105-115位和365-375位氨基酸處有明顯Jameson-Wolf抗原表位優(yōu)勢(shì)，CDV LP野毒株N蛋白在475-485位氨基酸處有明顯Jameson-Wolf抗原表位優(yōu)勢(shì)，這種抗原表位差異提示CDV LP毒株N和F蛋白的免疫原性可能要優(yōu)于Onderstepoort弱毒株。

不同毒株間氨基酸的變化很可能影響毒株的毒力和免疫原性，所以利用分子生物學(xué)方法對(duì)CDV LP野毒株N和F蛋白進(jìn)行了序列分析，闡明了CDV LP株是一株免疫原性較好的毒株，為以CDV LP株的N和F蛋白基因?yàn)槟康幕颍钊胙芯炕蛞呙绾椭亟M活載體疫苗打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

a.成功克隆了CDV LP株N和F蛋白全長(zhǎng)cDNA。N蛋白基因全長(zhǎng)1 571 bp，編碼523個(gè)氨基酸。F蛋白基因全長(zhǎng)1 989 bp，編碼662個(gè)氨基酸，含有17個(gè)半胱氨酸殘基，推導(dǎo)的F蛋白氨基酸序列中含有5個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)。

b.與GenBank中已發(fā)表的15個(gè)CDV毒株相比，F(xiàn)基因核苷酸的同源性在90.2%～100.0%；推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性在91.0%～100.0%之間。聚類分析表明CDV LP株是一株與CDV強(qiáng)毒株親源關(guān)系很近的毒株。

c.用DNAStar軟件對(duì)CDV LP株N蛋白和F蛋白進(jìn)行的疏水性及抗原表位預(yù)測(cè)分析表明CDV LP株N蛋白和F蛋白抗原表位優(yōu)勢(shì)要明顯優(yōu)于Onderstepoort弱毒株，在分子水平上闡明了其免疫原性要優(yōu)于Onderstepoort疫苗株的原因。

[1]葛艷華.Asia-1型犬瘟熱病毒分離株H蛋白免疫原性分析及重組犬腺病毒2型的構(gòu)建[D].哈爾濱∶東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2009∶1-2.

[2]Deem S L,Spelman L H,Yates R A,et al.Canine distemper in terrestrial carnivores∶a review[J].J Zoo Wildl Med,2000,31(4)∶441-451.

[3]Evermann J F,Leathers C W,Gorham J R,et al.Pathogenesis of two strains of lion(Panthera leo)morbillivirus in ferrets(Mustela putoriusfuro)[J].VetPathol,2001,38(3)∶311-316.

[4]Rima B K,Duprex W P.Morbilliviruses and human disease[J].J Pathol,2006,208(2)∶199-214.

[5]Beauverger P,Buckland R,Wild T F.Measles virus antigens induce both type-specific and canine distemper virus cross-reactive cytotoxic T lymphocytes in mice∶localization of a common Ld-restricted nucleoproteinepitope[J].JGenVirol,1993,74(11)∶2357-2363.

[6]Beauverger P,Chadwick J,Buckland R,et al.Serotype-specific and caninedistemperviruscross-reactiveH-2Kk-restrictedcytotoxicT lymphocyte epitopes in the measles virus nucleoprotein[J].Virology,1994,203(1)∶172-177.

[7]Pare J A,Barker I K,Crawshaw G J,et al.Humoral response and protection from experimental challenge following vaccination of raccoon pups with a modified-live canine distemper virus vaccine[J].JWildlDis,1999,35(3)∶430-439.

[8]Endo Y,Uema M,Miura R,et al.Prevalence of canine distemper virus,feline immunodeficiency virus and feline leukemia virus in captive African lions(Panthera leo)in Japan[J].J Vet Med Sci,2004,66(12)∶1587-1589.

[9]Schadeck E B,Partidos C D,Fooks A R,et al.CTL epitopes identified with a defective recombinant adenovirus expressing measles virus nucleoprotein and evaluation of their protective capacity in mice[J].VirusRes,1999,65(1)∶75-86.

[10]Sambrook J,Russell D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂等譯.3版.北京∶科學(xué)出版社,2002.

[11]Stettler M,Zurbriggen A.Nucleotide and deduced amino acid sequences of the nucleocapsid protein of the virulent A75/17-CDV strain of canine distemper virus[J].Vet Microbiol,1995,44(2/4)∶211-217.