產(chǎn)芳香物質益生菌篩選及其對谷物食品發(fā)酵效果的研究

王青竹，高學軍，盧志勇，駱超超，劉曉飛，于 微，李學琳

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

隨著我國國民經(jīng)濟的增長，人民生活水平的提高，廣大消費者對飲食結構也有了新的更高的要求[1-2]。人們選擇飲食時不僅考慮能滿足營養(yǎng)的需求，同時也越來越考慮其風味、保健、治療效果[3]。在生產(chǎn)面包、糧食飲料及米酒等谷物發(fā)酵食品時，將有某些特性的益生菌加入其中，或是提高其營養(yǎng)價值，或是改良其風味，則將會生產(chǎn)出適合人們對其要求越來越高的飲食物品。近年來微生物產(chǎn)香由于更天然健康所以倍受關注[4]，Jean等研究發(fā)現(xiàn)微生物通過酶水解機制影響釀酒的芳香物質釋放[5]，許多學者對谷物發(fā)酵食品的產(chǎn)香進行了相關研究，劉信中等人通過對啤酒芳香性物質的氣相色譜質譜分析發(fā)現(xiàn)了其中包含乙醇、2-苯乙醇和乙酸異戊酯[6-7]，陳妙蘭等通過對白酒的芳香性物質的氣相色譜質譜分析發(fā)現(xiàn)了其中包含乙醇、2-苯乙醇、3-羥基2-丁酮、冰乙酸、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯和壬酸乙酯[8-10]，楊秀琴等通過對酸面團的芳香性物質進行氣相色譜質譜分析發(fā)現(xiàn)了其中包含乙醇、2-苯乙醇、3-羥基2-丁酮、甲酸丙酯和壬酸乙酯[11]。通過上述學者研究發(fā)現(xiàn)醇類和酯類對谷物發(fā)酵產(chǎn)品的芳香性有很大影響。

本試驗從谷物食品中篩選出66種菌種及實驗室保存的12種菌種，通過氣相色譜分析、PCR鑒定及Blast分析，最后選擇其中3種分別產(chǎn)芳香性物質乙醇、2-苯乙醇、甲酸丙酯最多的益生菌種，分別加到用面粉發(fā)酵饅頭、用玉米粉發(fā)酵發(fā)糕及制造飲料、用糯米粉發(fā)酵粘豆包及發(fā)酵飲料的過程中，以期在增加它們的風味方面有所改進，從而生產(chǎn)出更適應人們需求的具有良好風味性的新型饅頭、發(fā)糕、粘豆包、玉米飲料及大米乳酸飲料等食品。

1 材料與方法

1.1 材料

大列巴、饅頭、發(fā)面餅、麻花、白酒酒曲、米酒、玉米面、面粉、糯米（以上均為哈爾濱市食品市場地產(chǎn)產(chǎn)品）和本實驗室已有的12種菌株1.1625、1.0625、1.1086、1.9201、200402、200204、10.0353、10.0357、1.2471、1.2467、1.1482、1.29。

1.2 儀器與試劑

儀器：島津公司GC-14C氣相色譜儀、DM-inertwax 30 m×0.25 mm，ID 0.25 μm 氣相色譜柱、SHG-300高純氫發(fā)生器、SGK-2LB低噪音空氣泵、DH6000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱、SPX-250C型恒溫恒濕箱、TDL-5000B冷凍離心機。

試劑：乙醇（Ethanol）、3-羥基2-丁酮（3-Hydroxy-2-Butanone）、甲酸丙酯（Propyl Formate）、乙酸苯乙酯（Phenylethyl Acetate）、乙酸甲酯（以上均為色譜純）、乙酸乙酯（Ethyl Acetate）、壬酸乙酯（Ethyl Nonanoate）、冰乙酸（Acetic Acid）（以上均為分析純）、糖化酶、淀粉酶。

1.3 菌種篩選

1.3.1 試驗方法

將面包、麻花、饅頭、發(fā)面餅、大列巴、粘豆包等發(fā)酵谷物的生面團、白酒曲和米酒通過微生物培養(yǎng)分離，獲取單一菌種保存，將分離出的66種菌株和實驗室保存的12種菌株接入液態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h，離心取上清，上清液濾膜過濾后取2 μL樣品直接用氣相色譜儀進行檢測。

1.3.2 色譜檢測結果

氣相色譜選用M-inertwax 30 m×0.25 mm，ID 0.25 μm氣相色譜柱，在摸索好的條件下確定芳香物質的保留時間，得出標準曲線，然后對每個菌種進行檢測，每個樣品重復3次，最終測定含量。

1.3.3 菌種的鑒定

通過氣相色譜的檢測篩選出了1.0625、1.1086、1.2467、B3、B7、B9等6株菌種，然后通過初步鏡檢、糖發(fā)酵試驗確定菌種類型，然后利用16rDNA、18SrDNA鑒定及blast分析、特異性引物PCR等技術鑒定，鑒定結果為：AS 1.2467（嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus，GenBank：EU483 105.1）、AS1.0625（保加利亞乳桿菌 Lacbobacillus bulgaricus， GenBank:AB494733.1）、 AS1.1086（納豆芽孢桿菌Bacillus natto，GenBank:GU826165.1）、B7（釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，GenBank：AY251636.1）、B3（克魯斯假絲酵母 Candida krusei，GenBank：M55528.1）、B9（東方伊薩酵母 Issatchenkia orientalis，GenBank：DQ438180.1）。

最后通過相關文獻的查閱，得出結論有三株菌株適合應用到食品當中，即為1.2467號菌嗜酸乳桿菌、1.0625號菌保加利亞乳桿菌、B7號菌釀酒酵母。

1.4 發(fā)酵試驗

1.4.1 發(fā)酵饅頭、發(fā)糕和粘豆包

材料：面粉600 g、水300 mL。

做法：將所有面粉加入水300 mL混合成團，將面團均分為4組小面團，每個小面團再分為3個平行。第一組小面團為對照面團，第二組小面團接入嗜酸乳桿菌1 mL，第三組小面團接入保加利亞乳桿菌1 mL，第四組小面團接入釀酒酵母1 mL，將面團分別揉至有筋度，面團表皮光滑為止（約揉5～10 min）。將面團分別放在大碗中，覆蓋保鮮膜等它發(fā)酵至兩倍大，約45～50 min（天氣冷時發(fā)酵時間會延長）。發(fā)糕和粘豆包的制作方式如上，分別得到發(fā)糕面團1～4組和粘豆包面團1～4組，每組均有3個平行。等發(fā)糕和粘豆包面團發(fā)好后，每個面團做成大小均勻的饅頭上屜蒸，大約15 min。所得四組發(fā)酵產(chǎn)品從視覺、嗅覺、味覺三個感官角度進行評定，最后得出結論。

1.4.2 玉米面制作玉米飲料[12]

稱取等量的適量玉米面4份，編為四組，每組分3個平行，每個平行80 g玉米面，按1：2比例加水，200 U·g-1單位加入糖化酶，在121℃條件下滅菌20 min，即為玉米發(fā)酵料。第一組接種為空白組，第二組接種嗜酸乳桿菌，第三組接種保加利亞乳桿菌，第四組接種釀酒酵母，接種量均為0.3%～0.5%。發(fā)酵溫度43℃、發(fā)酵時間20 h。發(fā)酵完后就四組產(chǎn)品的特征香氣、口感、酒香、甜酸比、綜合風味打分比較[13]。

1.4.3 糯米制作糯米飲料[14]

糯米飲料制作方法如下：將大米分成4份120℃蒸汽殺菌10 min，編為4組，每組分為3個平行，每個平行大米30 g，水200 mL。第一組空白對照組接入淀粉酶，第二組接入嗜酸乳桿菌和淀粉酶，第三組接入保加利亞乳桿菌和淀粉酶，第四組接入釀酒酵母和淀粉酶，菌種接入量均為0.3%～0.5%、淀粉酶0.05%～0.2%，在30℃培養(yǎng)15 h。發(fā)酵完后就四組產(chǎn)品的特征香氣、口感、酒香、甜酸比、綜合風味打分比較。以上試驗經(jīng)由50人品嘗，從視覺、嗅覺、味覺等多個角度進行感官評定，以問卷調查的形式得出最終結果。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)芳香復制益生菌的篩選

結果見表1。

篩選出了 1.0625、1.1086、1.2467、B3、B7、B9等6株菌種，然后通過通用引物PCR、Blast分析及特異性引物PCR的鑒定，通過相關文獻的查閱，得出結論有3株菌株適合應用到食品當中，即為1.2467號菌嗜酸乳桿菌（1.2467）、1.0625號菌保加利亞乳桿菌（1.0625）、B7號菌釀酒酵母（2.1427）。其中1.2467號菌種產(chǎn)2-苯乙醇量最高，1.0625菌種產(chǎn)甲酸丙酯量最高，B7菌種產(chǎn)乙醇量最高。

表1 篩選出的菌株通過氣相色譜檢測所得芳香物質的含量Table1 Content of aromatic substances of selected strains by gas chromatography （mg·L-1）n=3

2.2 發(fā)酵結果

2.2.1 面粉發(fā)酵饅頭、玉米粉發(fā)酵發(fā)糕、糯米粉發(fā)酵粘豆包的感官評定

釀酒酵母產(chǎn)品口感稍甜、氣味醇香更適合發(fā)酵饅頭、發(fā)糕。在發(fā)酵饅頭、發(fā)糕、粘豆包時產(chǎn)品味覺偏酸，但產(chǎn)香效果良好適合與其他菌種混合發(fā)酵，以提高產(chǎn)香效果。嗜酸乳桿菌發(fā)酵饅頭、發(fā)糕、粘豆包等產(chǎn)品口味偏酸，香味不是十分明顯，故不適合發(fā)酵以上產(chǎn)品。結果見表2～4。

表2 不同菌種發(fā)酵饅頭的感官評定Table2 Sensory evaluation of bread fermented by different bacterium

表3 不同菌種發(fā)酵發(fā)糕的感官評定Table3 Sensory evaluation of steamed sponge cake fermented by different bacterium

表4 不同菌種發(fā)酵粘豆包的感官評定Table4 Sensory evaluation of rice cake fermented by different bacterium

2.2.2 玉米面制作玉米飲料、糯米制作糯米飲料的感官評定

由表5、6可知，嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)品口感微酸、氣味具有獨特米香，故發(fā)酵糯米和玉米酸性飲料比較適合，釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)品酒香味較濃郁，故發(fā)酵糯米和玉米酒精飲料比較適合。

表5 不同菌種發(fā)酵玉米飲料的感官評定Table5 Sensory evaluation of corn drink fermented by different bacterium

表6 不同菌種發(fā)酵糯米飲料的感官評定Table6 Sensory evaluation of sticky rice drink fermented by different bacterium

3 討論與結論

人類對食品的獲取，不僅是身體上的一種需求，也是心理上的一種享受。具有良好或獨特風味的食品，會使人們在心里上、感官上得到真正的滿足，并直接影響其對營養(yǎng)物的消化和吸收。在對發(fā)酵谷物中的菌種研究發(fā)現(xiàn)酸面團面包的產(chǎn)香與酵母和乳酸菌有很大關系，通過乳酸菌發(fā)酵可提高糯米飲料[15]和玉米飲料的品質和香味[16]，Dung等通過研究發(fā)現(xiàn)用多種酵母菌和霉菌發(fā)酵紫色糯米釀制的米酒具有獨特的芳香性[17]，酵母在發(fā)酵波爾多葡萄酒過程中對它的香氣也有很大影響[18]，乳酸菌對保加利亞當?shù)氐木凭燥嬃蟗oza風味也有調節(jié)作用[19]，作為北方特色傳統(tǒng)食品的粘豆包也可以通過對其中益生菌的調控達到改善其感官品質的目的[20]。

本試驗從谷物食品中篩選出66種菌種及實驗室保存的12種菌種，通過氣相色譜分析、PCR鑒定及Blast分析，最后選其中3種分別產(chǎn)芳香性物質乙醇、2-苯乙醇、甲酸丙酯最多的益生菌種分別為釀酒酵母、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌，我們用這三種菌種分別發(fā)酵饅頭、發(fā)糕、粘豆包和谷物乳酸飲料，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母適合發(fā)酵面食和發(fā)酵酒精性飲料，保加利亞乳桿菌適合面食增香和發(fā)酵谷物酸性飲料，嗜酸乳桿菌適合發(fā)酵谷物酸性飲料。

現(xiàn)在大部分的研究集中在對發(fā)酵食品產(chǎn)芳香物質的氣相色譜質譜分析和從感官判定益生菌對發(fā)酵食品產(chǎn)香的影響，本實驗通過氣相色譜對芳香性物質的檢測，從菌種產(chǎn)芳香性物質多少的角度入手，選擇了產(chǎn)芳香性物質較多的釀酒酵母、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌3種菌，再用這3種菌分別發(fā)酵不同種的發(fā)酵食品，從中選擇出最適合不同種發(fā)酵食品發(fā)酵的對應菌種，從而達到使發(fā)酵食品增香的目的，最終得到產(chǎn)香性能優(yōu)良的產(chǎn)品。在用釀酒酵母發(fā)酵饅頭、發(fā)糕和粘豆包的過程中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)品口感微甜，氣味醇香較適合發(fā)酵面食，保加利亞乳桿菌在發(fā)酵過程中氣味醇香，但發(fā)酵產(chǎn)品微酸，如果發(fā)酵面食需要在配方做出調整，嗜酸乳桿菌在發(fā)酵過程中口味偏酸，氣味也無突出效果，故不太適合發(fā)酵面食。嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵谷物飲料所得產(chǎn)品口感微酸、有米香味，適合發(fā)酵谷物酸性飲料。如果添加適量的糖進行調節(jié)，效果會更好。釀酒酵母發(fā)酵谷物飲料所得產(chǎn)品有酒香味，適合發(fā)酵酒精性飲料。

有報道單一的菌種發(fā)酵不能使發(fā)酵食品達到最佳效果，將乳酸菌和酵母按比例混合對發(fā)酵面食增香會有更好的效果[21]，保加利亞乳桿菌與嗜酸乳桿菌按比例混合對谷物發(fā)酵飲料也有更好的增香效果[22]，保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和釀酒酵母按比例組合添加到玉米發(fā)酵飲料中能產(chǎn)生獨特的味[23]。通過菌種的特性按照不同比例組合會產(chǎn)生不同的效果，也更能適應不同種的谷物發(fā)酵食品的需求，今后我們應再開展復合菌種發(fā)酵的相關研究。

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