利用AFLP技術篩選與哲羅魚Hucho taimen(Pallas)性別相關的分子標記

張 超， 佟廣香，匡友誼，張春雷,3，尹家勝*

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱 150070；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；3.云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201）

哲羅魚 Hucho taimen（Pallas）系鮭形目（Salmoniformes）、鮭科（Salmonidae）、哲羅魚屬（Hucho），是兇猛的大型冷水魚類。哲羅魚具有生長速度快、營養價值高等優良特性，是冷水性魚類中較好的馴養品種，目前馴化養殖及人工繁育已經獲得成功。哲羅魚繁殖[1]，生理學及染色體核型方面的研究國內已有報道[2-4]，在分子生物學方面，國內有利用微衛星和AFLP對哲羅魚遺傳多樣性研究的報道[5-7]，國外有對虹鱒的性別基因位點及鮭科魚類性染色體進行研究[8-11]，但在分析哲羅魚性別相關的分子標記方面，尚未見有報道。

AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism of DNA）技術結合了RFLP的穩定性和PCR的高效性，具有多態性豐富、DNA用量少、無需預知基因組的序列信息等特點[12]。已廣泛應用于遺傳連鎖圖譜的構建[13]、遺傳多樣性分析[14]、重要性狀的分子標記篩選等方面[15]。利用AFLP技術進行動物性別相關分子標記的尋找，國內外研究相對較少。相關的研究主要集中在植物領域[16-17]。在水產動物方面，僅在建鯉[18]、尼羅羅非魚[19-20]、半滑舌鰨[21-22]、虹鱒[10,23]、大西洋鮭[24]等幾種魚類中獲得與性別相關的分子標記，且在這些獲得的標記中，大部分標記與性別的連鎖關系還有待于進一步確定。而且有報道指出目前得到的一些性別特異標記具有很高的種系特異性[20]。本研究利用AFLP技術分析雌雄哲羅魚DNA水平的差異，尋找與性別相關的分子標記，以期為哲羅魚的性別鑒定及單性養殖提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

哲羅魚雌雄各10尾，體長范圍為70.2～104 cm，體重范圍為2.428～12.680 kg，均采自黑龍江水產研究所渤海冷水性魚實驗站，在性成熟期鑒定雌雄后剪取鰭條，于75%酒精中保存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測

將鰭條樣品在超純水中反復清洗多次，使乙醇完全揮發，提取方法參照文獻[25]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用分光光度計測定其純度和濃度，然后將DNA濃度調整至100 ng·μL-1備用。

1.2.2 AFLP分析

用限制性內切酶Eco RⅠ/TaqⅠ組合和Eco RⅠ/Tru9Ⅰ組合分別對基因組DNA進行雙酶切，然后T4DNA連接酶進行連接。具體操作步驟參照文獻[26]。接頭序列如下：

以連接產物為模板進行預擴增，預擴增產物稀釋后進行選擇性擴增。預擴增引物和選擇性引物序列見表1，擴增產物用10%聚丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺為29：1）凝膠電泳檢測，上樣5 μL，在恒壓（380 V）條件下電泳11 h后銀染，掃描儀成像。

1.3 數據分析

用Gel-pro4.5軟件分析獲得的AFLP電泳圖譜，根據標準100 bp DNA Ladder計算擴增片段的大小。統計方法參照文獻[26]，用Philip3.6軟件和TreeView軟件進行個體聚類分析，Bootstrap抽樣5 000次。

表1 引物序列Table1 Primers sequence

2 結果與分析

2.1 AFLP擴增結果及多態性分析

用25對E/PT引物組合和20對E/T引物組合對20尾哲羅魚個體進行AFLP擴增，25對E/PT引物組合共擴增出了958個位點，多態性位點為251個，多態性比例在4.76%～62.26%之間，平均多態性比例為25.068%；20對E/T引物組合共擴增出了971個位點，多態性位點為217個，多態性比例在6.98%～37.50%之間，平均多態性比例為22.175%，結果見表2。從表中可以看出，兩組酶切組合得出的結果相差不大，E/T引物組合擴增出的位點數稍多于E/PT引物組合，但多態性位點比例稍低于后者。綜合兩組數據來看，這20尾哲羅魚之間的多態性位點比例并不是很高，多態水平一般。

表2 哲羅魚中不同引物組合擴增的位點數及多態性位點比例Table2 Number of loci and ratio of polymorphic loci amplified by different AFLP primers in H.taimen

圖1為引物組合E3-PT3擴增的結果，圖2為引物組合E1-T8擴增的結果，多態性比例分別為25.00%和41.46%。 圖中標號1～10為雌魚，11～20為雄魚，箭頭所指處為多態位點，圖1中有兩個多態位點，圖2中有一個多態位點，這三個多態位點在雌雄哲羅魚中擴增出的比例存在一定的差異，說明這些多態位點與哲羅魚性別可能存在一定的相關性。

圖1 E3-PT3的擴增結果Fig.1 Electrophoretogram of H.taimen population amplified by primer combination E3-PT3

圖2 E1-T8的擴增結果Fig.2 Electrophoretogram of H.taimen population amplified by primer combination E1-T8

2.2 雌雄個體差異

分析45對引物組合的擴增結果，有15個位點在雌性和雄性個體中出現的比例存在很大的差異（大于50%），如引物組合E3-PT6擴增的分子質量為115 bp的位點在10個雄性個體中出現8個，而10個雌性個體中僅有1個出現；引物組合E2-T2擴增的分子質量為603 bp的位點在10個雌性個體中都有出現，而在10個雄性個體中只出現3個，結果見表3。這15個位點中雖然沒有找到哲羅魚雌雄特異位點，但每個位點在雌雄中擴增的比例相差都在50%以上，表明這些位點與哲羅魚性別存在很大的相關性，這些位點可能位于性染色體上或者性別決定基因附近區域。

利用popgene3.2版軟件計算雌雄兩個群體的觀測等位基因Na、有效等位基因Ne，Nei氏基因多樣性指數H和Shannon氏指數I，結果見表4、5。由表中可以看出，兩組酶切組合所得到的結果不同，E/PT組合獲得的遺傳多樣性參數是雌性略高于雄性，而E/T組合則是雄性略高于雌性，總體來看，兩組酶切組合得出的數據均較低，由此可以得出哲羅魚群體遺傳多樣性較低，但將雌雄群體分開來看，兩群體之間遺傳多樣性參數差異并不大，說明在進化過程中雌雄群體的遺傳分化程度不大，所以從DNA角度來看，哲羅魚雌雄群體之間的差別不大，多態性水平一般。

表3 哲羅魚雌雄個體在15個位點出現的比例差異Table3 Differences of distribution in 15 loci between female and male groups of H.taimen

表4 E/PT組合獲得的遺傳多樣性參數Table4 Parameters of genetic diversity by E/PT combination

表5 E/T組合獲得的遺傳多樣性參數Table5 Parameters of genetic diversity by E/T combination

用Phylip3.6軟件計算遺傳距離，并進行5 000次Bootstrap檢驗系統樹的可靠性，圖3是由表3中的15個位點繪制的哲羅魚個體聚類圖。從圖3可以看出雌魚聚集在系統樹上部，雄魚聚集在系統樹下部，這說明相同性別的魚之間遺傳距離較近，優先聚為一組，而與不同性別的魚之間的遺傳距離較遠，這也同樣表明這15個多態位點與哲羅魚性別之間存在很大的相關性。

圖3 哲羅魚個體聚類圖Fig.3 Individuals dendrogram of H.taimen

3 討論與結論

AFLP標記技術能產生分布于整個基因組的分子標記，位點豐富，但是操作過程繁瑣，任何一步的疏忽都會影響試驗結果。本試驗參照文獻[26]采用了最適的酶量、酶切時間、連接時間及選擇性擴增時的稀釋倍數，將100 ng DNA用3 U的Eco RⅠ、3 U的TaqⅠ和Tru9Ⅰ分別先后酶切3、4 h，然后用2 U的T4DNA連接酶連接3 h，取3 μL連接產物進行預擴增，預擴增產物稀釋50倍進行選擇性擴增，得到了最可靠的結果。

本研究用45對引物組合進行試驗分析，結果未發現與性別相關的特異性位點，但某些位點在雌雄個體中出現的比例存在很大的差異。這些位點可能與哲羅魚的性別有一定的關聯，推測這些位點可能位于性別決定基因的相鄰區域，但與哲羅魚遺傳性別的確切關系還有待于進一步研究。雌雄個體出現比例差異較大的15個位點的聚類分析結果也表明雌雄個體具有一定的遺傳分化，同性個體優先聚類。

鮭科魚類性別方面的研究多是國外學者們進行的，主要集中在對虹鱒的研究。Iturra等利用RAPD方法獲得兩個虹鱒雄性特異分子標記，并將其中一個標記轉化為SCAR標記，命名為OmyP9，然后將其作為探針，采用FISH法將該標記定位于Y染色體上[10]；同時，還采用FISH法，利用虹鱒的性別標記OmyP9和5s rDNA、GH2基因作為FISH法的探針，特征化了虹鱒性別染色體，并鑒別了銀大麻哈魚的性染色體[27]，這表明OmyP9這個性別標記在虹鱒和銀大麻哈魚中可以通用。虹鱒和銀大麻哈魚同屬鮭科魚類的大麻哈魚屬，所以這些性別標記在屬內并不存在種系特異性；Felip等將虹鱒15個性別相關AFLP分子標記轉化為SCAR標記，并在虹鱒四個遺傳多態的雄性克隆系內將其中一個Y染色體連鎖標記Omy-163定位于性別位點附近[23]；Alfaqih等將虹鱒5個候選性別決定基因與Y染色體進行了連鎖[8]，Brunelli等已經成功獲得了虹鱒的Y染色體序列[28]。由此可見，虹鱒的性染色體已經確定為Y染色體，而且已經獲得了Y染色體的序列及多個性別相關的分子標記和候選性別決定基因。本文作者根據已公布的虹鱒的OmyP9、Omy-163和GH2基因等性別標記的序列設計了18對引物，采用SSCP技術篩選哲羅魚性別的分子標記，未能發現哲羅魚雌雄差異。這可能是由于虹鱒和哲羅魚雖同屬鮭科，但不同屬，而性別標記又存在屬間特異性，所以虹鱒的性別標記不能應用于哲羅魚。既然哲羅魚與虹鱒同屬鮭科魚類，在遺傳進化方面存在許多共同之處，可以參考虹鱒性別方面的研究方法對哲羅魚性染色體及性別相關分子標記進行研究。

分析本研究未發現性別特異位點的可能原因有以下兩方面：①AFLP技術是針對于整個基因組序列進行擴增，而與性別相關的基因數量較少，因此采用該技術尋找哲羅魚雌雄之間的差異存在一定的困難；②本研究所用的引物組合較少，樣本量也較少，所以擴增出的多態性位點不是很多，若采用多種雌雄差異分析方法，或者選用更多的選擇性擴增引物，改進電泳條件，檢測更多的雌雄差異位點，將更有助于尋找到雌雄特異位點。另外，魚類的性別不僅與遺傳因素有關，還與環境因素有一定的關系，可以分為遺傳性別和生理性別，遺傳性別和生理性別的不統一也會造成實驗數據的不準確，在某些雌雄出現比例差異很大的位點上，如E2-PT3，雄性個體均有出現，而雌性個體只有3個出現，這3個個體有可能在生理上屬雌性，而在遺傳上屬雄性，因此用性別特異位點鑒定性別時，其準確性并不能夠達到100%，即使獲得某個雌雄特異位點，擴大樣本量分析時也不能保證其能夠完全鑒定出雌雄。

哲羅魚是我國的瀕危物種，同時也是一個優良的淡水養殖品種。哲羅魚的雌雄從外形上很難分辨，因此開發哲羅魚性別的特異性標記，對其進行性別鑒定，可以對雌雄群體進行不同性狀的定向選育，形成不同性狀的優良品種；或分別對雌雄群體進行雜交獲得具有雜種優勢的后代。本文雖然沒有找到哲羅魚雌雄特異位點，但該研究積累的大量AFLP分析結果和數據，可作為哲羅魚的遺傳背景資料，為哲羅魚性別或其他方面的進一步研究提供參考。

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