飼料中硒的測定—氫化物發生原子熒光光譜法

杜英秋，廖 輝，馬永華，陳國友，蘇 萍，單 宏

（黑龍江省農業科學院農產品質量檢驗中心，哈爾濱 150086）

硒是動物成長所必須的重要微量元素之一，它存在于肝、腎、肌肉和肌體的所有細胞中，硒的缺乏會導致畜禽機體功能異常和死亡，也會影響動物的繁殖過程[1-5]。飼料是畜禽硒的良好來源，而飼料中硒的含量主要受地區土壤影響，我國2/3以上地區屬于缺硒地區，這些地區的配合飼料中硒含量比較低，在這些缺硒和嚴重缺硒的地區幾乎所有動物飼料中都添加硒[6-8]。由于動物對硒的需要量和中毒量相差不大，硒的過量同樣會對動物機體造成不良影響，甚至毒害作用。因此，為了防止硒缺乏癥的發生，同時又防止硒過量，各國都對畜禽飼料的含硒量做了規定，準確控制動物硒的攝入量[9]。測定硒的常用方法有熒光法、原子吸收法和比色法等，熒光法雖然準確但繁瑣，并且所用試劑DAN毒性大且需進口；原子吸收法、火焰法靈敏度低，石墨爐法有嚴重的基體干擾；比色法雖然簡便但靈敏度低[10]。目前，農業部行業標準中尚無飼料中硒的測定方法，國標方法中測定硒采用的是熒光法[11-13]。本文利用原子熒光光譜法測定飼料中硒的含量，靈敏度高，檢出限低，可以準確的測得飼料中硒的含量，為飼料中硒的添加提供可靠的數據保障。

1 材料與方法

1.1 儀器

AFS-230E雙道原子熒光光度計（北京海光儀器公司）；硒空心陰極燈（北京有色金屬研究總院）；可調式電熱板，所用的玻璃儀器需用25%的硝酸浸泡過夜，用超純水清洗干凈。

1.2 試劑

硒標準儲備液：1 000 μg·mL-1（國家標準物質中心）；硒標準工作液：將硒標準儲備液用10%HCl逐級稀釋至 0.25 μg·mL-1；硼氫化鉀溶液（15 g·L-1）：稱取硼氫化鉀7.5 g溶于5 g·L-1的氫氧化鉀中，定容至500 mL；硝酸、高氯酸、鹽酸均為優級純試劑；鐵氰化鉀溶液（100 g·L-1）：稱取鐵氰化鉀10.0 g溶于水后定容至100 mL，臨用前現配；標準物質：GBW0010（大米）、GBW0018（雞肉）；試驗所用水均為超純水。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

①配合飼料、濃縮飼料、單一飼料：稱取試樣1.0 g（精確至0.0001 g）于250 mL錐形瓶中，加入硝酸10 mL，錐形瓶上放上小漏斗用于消煮試樣時起回流作用，放置過夜。次日，進行低溫（本試驗電熱板電壓為170 V）消煮，硒為揮發元素，溫度過高會導致硒的損失。當消煮體積減少到5 mL左右，取下稍冷，向其中加入2.5 mL高氯酸，繼續低溫加熱，先是產生棕色煙，繼續加熱冒白煙，消化液為無色透明或是淺色近透明，液體體積剩余2 mL左右，取下稍冷，然后向其中加入5 mL濃度為6 mol·L-1的鹽酸，繼續低溫加熱，至剩余2 mL左右時取下，冷卻，轉移至25 mL容量瓶中，再向容量瓶中加入2.5 mL鐵氰化鉀，2.5 mL濃鹽酸，定容，混勻待測。

②高含量硒樣品、預混飼料：這些樣品中硒的含量比較高，很多樣品的硒含量達到2 mg·kg-1以上，所以樣品必須經過稀釋后才可以測定。具體如下，樣品消煮部分同①至加入5 mL濃度為6 mol·L-1的鹽酸后繼續低溫加熱，至剩余2 mL左右時取下，冷卻。然后將消解液轉移至25 mL容量瓶中直接定容。定容后根據樣品中硒的含量進行稀釋，根據稀釋的體積向其中加入鹽酸和鐵氰化鉀溶液，保證稀釋液中鹽酸的濃度為10%，搖勻待測。

③以石粉為載體的預混料：稱取試樣1.0 g（精確至0.0001 g）于250 mL錐形瓶中，加入硝酸15 mL（加入硝酸時，先逐滴加入，至不再產生氣泡后，再將剩余硝酸加入，否則硝酸與其中的石粉載體反應過于劇烈），放置過夜，接下來的步驟同①。

1.3.2 標準系列的配制

吸取硒標準工作溶液，加入濃鹽酸2.5 mL，鐵氰化鉀（100 g·L-1）溶液 2.5 mL，用純水定容至25 mL，配制成含硒為0.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng·mL-1的標準系列，標準曲線最好現用現配，如放置時間過長會使測定結果偏高。放置30 min后測定。

1.3.3 儀器參考條件

結果見表1。

1.3.4 測定

光度計開機后按儀器參考條件進行設定，預熱30 min后，依次測定標準系列、樣品空白和樣品部分。

1.3.5 檢出限與線性范圍

在給定的儀器工作條件下，對空白溶液與試驗用標準溶液交替測定12次，進行儀器檢出限測定，結果見表2。

檢出限的測定[12]：檢出限（ng·mL-1）=C×3б/A

其中，C-試驗溶液的濃度；б-12次測定空白溶液熒光強度值的標準偏差；A-試驗溶液的平均熒光強度值。計算得出硒的檢出限為0.02 ng·mL-1，飼料稱取1.0000 g，定容至25 mL，得到樣品的最低檢出限為 0.5 μg·kg-1。

表1 儀器條件Table 1 Condition of instrument

表2 檢出限數據Table 2 Data of detection limit

在儀器給定的工作條件下，對標準系列測定的If值以及回歸方程見表3。

從表3數據可知，標準曲線在0～50 ng·mL-1內，相關系數達到0.9999，曲線線性良好。

表3 標準曲線Table 3 Standard curve

2 結果與分析

2.1 干擾及其消除方法

Al、Fe、Ca、Mg、Na、 K、Ti及 Cl-、F-、NO3-、SO42-、PO43-不干擾硒的測定。在 4 mol·L-1HCl酸度、Fe3+的加入量為 8 mg·L-1時，0.1 g·mL-1Se，下列元素在如下濃度不干擾測定：Ni 2 000 μg·mL-1、Cu 400 μg·mL-1、Pb 1 500 μg·mL-1、As 100 μg·mL-1、Sb 140 μg·mL-1、Bi 70 μg·mL-1、Sn 140 μg·mL-1、Ge 19 μg·mL-1、Hg 15 μg·mL-1、Te 0.5 μg·mL-1、Ag 0.2 μg·mL-1、Au 0.2 μg·mL-1、Pd 0.2 μg·mL-1。氫化物發生原子吸收法中觀察到Sn對Se測定有嚴重干擾，而氫化物原子熒光法中未發現。對于基體成分復雜，而Se的含量較低的樣品，可采用萃取，巰基棉吸附，離子交換等分離富集方法來消除干擾。

2.2 硼氫化鉀溶液濃度的選擇

作為預還原劑硼氫化鉀的濃度選擇很重要，對不同濃度0.5%、1.5%、3.0%、4.0%的硼氫化鉀溶液進行試驗，結果見表4。

對于預還原劑硼氰化鉀，如果濃度太低，還原能力弱，靈敏度低，濃度過高時，標液熒光強度增加，但是空白也隨著增加，而且產生的大量氫氣會對樣品的測定產生氣體干擾。最后選擇1.5%為最適宜的硼氰化鉀濃度，在此濃度下，所測得的曲線見表3，線性好，曲線各點的If值可以滿足試驗需要。

表4 硼氫化鉀溶液濃度的選擇Table 4 Choice of the concentration of KBH4

2.3 載流介質及載流濃度的選擇

在樣品的前處理部分，加入6 mol·L-1的鹽酸，將消化液轉移至容量瓶，加入的也是鹽酸，為了減少酸種類不同造成的系統誤差，載流的選擇為鹽酸。對于載流濃度的選擇，本試驗選擇了5%、10%、20%、30%的鹽酸溶液分別為載流進行試驗，結果見表5。

從表5可知，隨著載流濃度的變化，If值沒有明顯變化。經過消化和定容后的樣品中酸度約為10%，為了減少儀器由于酸度不同造成的系統誤差，選擇濃度為10%的鹽酸溶液為載流是最合適的。

表5 載流濃度的選擇Table 5 Choice of the concentration of carry liquid

2.4 測定結果

按照本試驗測定方法，對飼料樣品進行5次平行消化處理、測定，結果的精密度、重復性、準確性和根據穩健統計對可疑值的判斷結果見表6。

相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD），也稱變異系數（Coefficient of Variation，CV）。試驗分析時，常用RSD表示精密度，它是表示測量的再現性，是保證準確度的先決條件。從檢測數據可知，分別對飼料1、飼料2檢測的5組數據，RSD分別為3.12%和2.08%，說明此方法下，對樣品進行檢測，隨機誤差小，檢測數據再現性高，這是檢測數據準確的前提保證。

本試驗中，以國家標準物質GBW0010和GB W0018作為質控樣，它們的標準值分別為0.061±0.015、0.49±0.06（mg·kg-1），從表7可知檢測結果均處于標準值的允許范圍之內，完全符合規定，且RSD較小，數值之間的重復性高，即做到了精確又做到了準確。

表6 精密度試驗Table 6 Test of the precision

表7 準確度試驗Table 7 Test of the precision

2.5 回收率試驗

向供試的國家標準物質和飼料樣品中分別添加標準溶液，在同樣試驗條件下，做添加回收率試驗，回收率結果見表8。

加標回收是指在前處理過程中，向固體樣品中加入標準物質，然后一起消解，最后變成溶液，然后測定含量，來確定樣品的回收效果。做加標回收率的目的主要是為了驗證所用方法的準確性和可靠性，可以判斷在進行樣品處理時是否會造成分析組分的損失或帶來分析組分的沾污。其計算公式為：

結果處于90%～110%為合格。從表8可知，向國家標準物質和飼料1中添加硒標準物質，在此方法下檢測數據均處于90%～110%之間，說明此方法整個分析過程合理、可靠。

表8 添加回收率試驗Table 8 Test of the added recovery rate

3 討論與結論

本文采用電加熱濕法消化、氫化物發生原子熒光光譜法測定飼料中的硒，在嚴格控制消化溫度的基礎上，分析優化了硼氫化鉀溶液的最佳濃度、載流介質和載流濃度等因素對試驗結果的影響，并通過國家標準物質和添加回收率試驗驗證該方法對飼料樣品中硒測定的準確性、重復性、可靠性。

a.與測定硒的常用方法熒光法、原子吸收法和比色法相比，熒光法繁瑣，且所用試劑DAN毒性大；原子吸收法、火焰法靈敏度低，石墨爐法有嚴重的基體干擾；比色法靈敏度低。此方法彌補了上述方法的不足，具有無毒、靈敏、準確等優點。針對目前飼料中硒測定的行業標準還為空白，更可為制定此行業標準提供方法準備。

b.通過本試驗，找到了應用AFS-230S測定飼料中硒的最佳方法∶光電倍增管負高壓為290 V，原子化器高度為8 mm，燈電流為70 mA，載氣流量為400 mL·min-1，屏蔽氣流量為 1 000 mL·min-1，讀數時間為11 s，測量方式為標準曲線法，延時時間為1.0 s，讀數方式為峰面積。

c.通過測定發現不同飼料中硒含量差距很大，該方法適合不同類型飼料硒的測定，能夠滿足日常工作的需要，是檢測和監測飼料中硒含量的一種良分析方法，具有很好的可行性和實用性，能起到嚴把質量關的作用，為人民的飲食和健康保駕護航。

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