德國牧羊犬精液冷凍保存的研究

黃 賀，趙 騫

（東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030）

德國牧羊犬以其威武兇悍、訓練有素及“天然警犬”而著稱于世。目前，我國已建立起德國牧羊犬的繁殖體系，從保存、繁育、使用情況來看，完全適應了公安、部隊及國防建設的需要[1]。早在1780年，意大利生理學家Spallannani第一次用犬進行了AI試驗[2]。Seager首次報道了犬的凍精AI獲得成功[3]，之后相繼建立了有關精液品質、冷凍及AI的一系列參數[4]。武石昌敬等也曾報道了犬冷凍精液AI[5]。潘壽文等首先對德國牧羊犬進行精液冷凍和AI進行研究并獲得成功[6]，受胎率為22%，平均窩產仔數2條，王力波等對德國牧羊犬的精液冷凍研究也獲得成功，受胎率和產仔數有所提高[7]。為了提高種公犬的配種效能、延長精液保存時間、提高牧犬受胎率和窩產仔數，本研究對牧羊犬的精液進行冷凍保存研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

從黑龍江省哈爾濱市天尚犬舍選擇圈養的雄性牧羊犬4條，體重15～25 kg，年齡2～5歲。飼料為配合日糧，每日散放運動，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 稀釋液和凍精劑型對犬精凍后活率影響

本研究以凍精解凍后的活率作為評定標準，比較4種稀釋液（見表1）和兩種凍精劑型（0.1 mL顆粒、0.5 mL細管）牧羊犬精液冷凍復蘇后的活率，從而篩選出最佳稀釋液配方和凍精劑型。為減少試驗組間差異，在進行四種稀釋液和兩種精液冷凍劑型對犬精液凍后活率的影響的研究時，將4只公犬的精液進行混合處理[5-6]。試驗采用兩因子有重復交叉分組設計，重復10次。

表1 四種稀釋液配方Table 1 Formulations of four kinds of dilution

1.2.2 精液冷凍

分別采集4只公犬的精液各40次，進行品質檢查后，分別離心（1 000 r·min-1，5 min）棄去精清，加37℃稀釋液稀釋至與離心前等量，封口后，先在離心管外纏數層紗布，然后外面再纏塑料袋并封口，放入4℃的冰箱，平衡4 h，取出，加入與精液等量的4℃稀釋液，4℃冰箱內放置30 min。

（1）細管劑型的精液采用程序冷凍法：

（2）顆粒劑型的精液采用炸熏冷凍法：

將0.1 mL精液直接滴入液氮中，靜置5～8 s取出后，再用液氮熏蒸8 min。

精液解凍采取溫水解凍的方式，將凍精從液氮中取出，立即投入40℃水浴10 s，檢查活率。

2 結果與分析

2.1 不同犬精液指標的比較

4只公犬的精液指標表明（見表2），4只公犬的射精量、精子活率和精子密度均達到正常標準，且組間差異均不顯著，可以排除個體間差異對試驗結果的影響。

表2 4只公犬的精液指標Table 2 Semen index of four male dogs

2.2 不同稀釋液和凍精劑型對犬精液凍后活率影響的檢測結果

四種稀釋液和兩種精液冷凍劑型的試驗結果見表3。在稀釋液2中，顆粒凍精的解凍后活率（0.44±0.02）顯著高于稀釋液 1（0.36±0.01）、稀釋液3（0.37±0.02）和稀釋液 4（0.30±0.03）（P＜0.05），稀釋液1、稀釋液3和稀釋液4間差異不顯著（P＞0.05）；顆粒凍精和細管凍精之間差異顯著（P＜0.05），說明采用稀釋液2配方和炸熏法冷凍精液時，顆粒凍精可獲得較高活率。

表3 四種稀釋液和兩種精液冷凍劑型對犬精液凍后活率影響的檢測結果Table 3 Effect to the sperm motility of four kinds of dilution and two kinds of semen frozen formulations

2.3 不同冷凍方式對犬凍精活率影響的檢測結果

對四只公犬的精液進行炸熏法和程序冷凍法冷凍，炸熏法冷凍的精液凍后活率顯著高于程序冷凍法冷凍的精液，說明德國牧羊犬的精液采用炸熏法可獲得較高的凍后活率。試驗結果表明，炸熏法的冷凍效果明顯優于程序程序冷凍法（見表4）。

表4 不同冷凍方式對犬精液凍后活率的影響Table 4 Effect to the sperm motility of frozen semen of different ways in dogs

3 討論

3.1 犬精液的冷凍方式

冷凍精液的實質是精液與周圍的冷源環境進行能量交換的過程，精液在冷凍過程中釋放出一定的能量后，便由液相變為固相[9]。在這個過程中，對精子有害溫度區為0～60℃的冰晶化溫度區。因為降溫速率與精子的凍后活率和細胞結構完整性存在高度的相關性，降溫過快會在細胞內形成冰結晶而導致精子死亡和細胞結構受損，而降溫過慢則會因細胞外的溶質濃度升高，pH升高而導致精子死亡[10]。此外，由于在相同冷凍條件下不同稀釋液的滲透壓及pH變化幅度不同，因此，不同的冷凍液對冷凍的程序要求不同。禹學禮等建立了犬精液冷凍的炸熏法，與氟板法相比，凍后活率明顯提高（P＜0.01）[8]。本試驗是在國內外同類研究的基礎上，對犬顆粒精液和細管精液的冷凍方式進行的初步研究，結果表明炸熏法的冷凍效果明顯優于程序冷凍法。

3.2 犬精液的冷凍劑型

犬精液的劑型主要有顆粒、細管和安瓿三種，各有優劣，不同研究者觀點也不一致。Olar等認為細管精液易于標記、貯存和解凍，比顆粒和安瓿精液更實用[11]，Seager等認為，顆粒凍精應該被細管和安瓿精液所取代[3]。潘壽文等認為，從生產的角度，安瓿劑型優于顆粒[6]。禹學禮的研究結果表明，顆粒凍精的凍后活率顯著高于細管和安瓿（P＜0.01）[8]。在顆粒和細管兩種劑型中，雖然單個顆粒凍精內的有效精子數少，但顆粒冷凍方便、凍后活率高、精液利用率高，輸精時，只要將數個或十數個顆粒解凍后收集起來使用，既可克服其有效精子不足的弱點，又提高了精液的利用率。因此顆粒凍精更值得在犬的精液冷凍和AI中得到推廣和應用。

4 結論

采用卵黃-Tris為主的稀釋液2，應用顆粒炸熏法對犬的精液進行冷凍保存效果明顯優于細管程序冷凍；在同一種稀釋液中顆粒凍精的凍后活率高于細管凍精。

[1]王憲龍,劉彥,曾申明.國外犬精液冷凍技術的研究進展[J].中國畜牧雜志,2008,15(2)∶12-16.

[2]張忠誠.動物繁殖學[M].北京∶中國農業出版社,2004.

[3]Seager.Storage of boar semen[J].AI Digest,1969,27(3)∶6.

[4]Seager.Relation of semen quality tosperm transport,fertilization and embryo quality in ruminants[J].Reprod J Fertil,1975,45∶189-192.

[5]武石昌敬.犬的人工授精技術[J].家畜繁殖學雜志,1976,22(1)∶28-32.

[6]潘壽文,劉湖,馬大君.犬的精液冷凍技術[J].畜牧與獸醫,1986,2(3)∶105-106.

[7]王力波,楊殿軍,周向陽,等.犬精液冷凍及人工授精的研究[J].黑龍江畜牧獸醫,1991(5)∶35-36.

[8]禹學禮,龐有志,栗穎華,等.炸熏法冷凍犬精液的試驗[J].中國獸醫學報,1997(3)∶289-291.

[9]趙祥杰,李玉田,孫爽,等.精液顆粒冷凍技術的研究[J].東北農業大學學報,2008,39(3)∶70-75.

[10]Lian Z X,Li W.Biological effects of deer semen on development of testes in mice[J].Journal of Northeast Agricultural University∶English Editon,1997,4(1)∶52-54.

[11]Olar,Bowen,Pickett.Influence of extender,cryoperservative and seminal proccessing procedures on postthaw motility of canine spermatozoa frozen in straws[J].Theriogenology,1989,31(2)∶451.

*趙騫為本文的同等貢獻者。