枯草芽孢桿菌apr基因的克隆和表達

張東杰，馬中蘇

（1.吉林大學生物與農業工程學院，長春 130022；2.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

大豆抗氧化肽是蛋白水解產物中具有清除烴基自由基[1]、終止單線態氧的生成[2]、鰲合重金屬離子捕捉體內自由基[3]等抗氧化功效的部分，具有抗氧化、延緩機體衰老、調節機體免疫等生理功能，可在一定程度上消除機體內多種生理功能的障礙，降低各種老年性疾病的發生幾率[4-5]。目前國內外多是采用商品蛋白酶水解法和微生物發酵法降解大豆蛋白制備抗氧化肽，據統計當前世界工業生產酶市值10億美元，蛋白酶占工業生產酶的三分之一，75%為水解酶類，市值約占60%；而工業蛋白酶的50%都是微生物法生產的[6]，上個世紀80年代，僅芽孢桿菌中蛋白酶就占據商品酶總產量的38%[7]。目前，生物技術被應用大幅度地提高芽孢桿菌中性蛋白酶的產量，Apr基因編碼的中性蛋白酶，是枯草芽胞桿菌AS1.398中作用較突出的一種。該酶主要在中性條件下催化蛋白質肽鍵水解，將蛋白質分解為蛋白胨、多肽及游離氨基酸等。熱穩定性好，工藝簡單，生產應用不易受溫度影響而鈍化，在較高溫度下還可抑制有害微生物的生長。最適pH 7.2～7.4，最適溫度42～44℃，發酵生產的粗酶液活力為8 000～10 000 U·mL-1[8]。本試驗就在基因工程菌株生長快速、生長周期短、培養條件簡單、安全性好、價格低廉、可以高效表達外源蛋白、易于進行工廠化批量生產[9-10]等優點的基礎上，研究制備抗氧化肽的新方法，為提高農產品附加值研究奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

Bacillus subtilis AS 1.389（廣東省微生物研究所菌種保藏中心）；大腸桿菌TOP10和 pGM-T Vector（北京天根生化科技有限公司）；PET-22b（本實驗室保存）。

TaKaRa Taq DNA聚合酶、限制性內切酶KpnⅠ和Bam HⅠ（大連寶生物工程有限公司）；200 bp DNA Ladder、X-gal和IPTG及普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提取試劑盒（離心柱型）和pGM-T克隆試劑盒（北京天為時代科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Bacillus subtilis總DNA的提取

參照王穎等的提取方法[11]。

1.2.2 PCR擴增特異性基因片斷

根據GenBank中的枯草芽孢桿菌蛋白酶的基因序列[12]，用Oligo6.0和Primer5.0軟件設計合成一對特異性引物，并分別在上下游引物中加入KpnⅠ和Bam HⅠ位點。上游引物P1的序列為：5'GGAT CCTGACCAGTATGGGATCGAGTT 3'（27 bp），下游引物P2的序列為：5'AAGCT TAGAGGGTAAAGAG TGAGAAGCAAA 3'（30 bp）。PCR反應體系為50 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 PCR產物的克隆和重組質粒的鑒定

DNA回收試劑盒回收PCR產物，對所獲得產物通過連接載體、X-gal/IPTG藍白斑篩選獲得單克隆菌落，陽性克隆送寶生物公司測序，正確的重組質粒命名為pGM-T/apr。

1.2.4 原核表達質粒pET-22b（+）-apr的構建和鑒定

PCR產物和pET-22b（+），進行KpnⅠ和Bam HⅠ雙酶切，將純化的DNA片段與線性化的pET-22b（+）載體連接，熱激轉化 E.coli BL21（DE3）感受態細胞。篩選陽性克隆，提取質粒，酶切及PCR鑒定并測序。鑒定正確的重組質粒命名為pET-22b（+）-apr。將apr基因序列資料輸入DNAsis分析軟件進行序列分析，并分別輸入Blastn和Blastp，與基因庫中的同源株核苷酸和蛋白質進行同源性比較。

1.2.5 融合蛋白的誘導表達

挑選陽性菌株的單菌落，接種于3 mL LB培養基，37℃培養12 h，2%的接種量轉接至50 mL新鮮LB培養基，37℃ 培養至OD600為0.7，加入IPTG 至終濃度為 1 mmol·L-1，37°C誘導5 h，離心收集細菌。在冰上超聲波破碎菌體，180 W、5 min，收集上清與沉淀進行SDS-PAGE，以未誘導菌液及DE3菌液為對照。

1.2.6 蛋白的酶活測定

按照中國輕工業部頒部標準QB747-80（工業用蛋白酶測定方法）規定的Folin法測定酶活[13]。1 mL酶液在40℃，pH 10.5，每分鐘反應產生1 μg酪氨酸所需要的酶量為1個酶活力單位（U）。

2 結果與分析

2.1 Bacillus subtilis總DNA的提取

以LB液體培養基37℃增殖培養10～12 h，經RNaseA去除RNA污染，得到高質量DNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（見圖1）。

2.2 apr基因的克隆和鑒定

通過PCR法，擴增apr基因，擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在1.5～1.6 kb處可見一條與預期大小（1 509 bp）相符的特異性條帶，結果見圖2。提取重組質粒pGM-T/apr，經Bam HⅠ和KpnⅠ雙酶切，結果呈現與預期結果（1 509和5 493 bp）相符的2條帶（見圖3）。DNA序列分析顯示插入的 apr 基因片段與 GenBank（No.lcl｜25247）中已報道的序列大小一致，二者的基因同源性為100%，氨基酸序列一致性為100%。

2.3 原核表達質粒的構建與鑒定

將Bam HⅠ/KpnⅠ雙酶切處理過的重組質粒pGM-T/apr和原核表達載體 PET-22b（+），T4DNA鏈接酶過夜連接，構建表達質粒pET-22b（+）-apr。Bam HⅠ/KpnⅠ雙酶切該重組質粒，出現與預期大小一致的兩條帶，結果見圖4。PCR鑒定結果片段大小與預計一致。測序結果顯示，重組質粒中插入的目的DNA的序列與預計的序列相比較同源性達100%。

圖1 Bacillus subtilis基因組DNA電泳圖Fig.1 Result of extraction of Bacillus subtilis genome

圖2 PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR amplificcation

圖3 重組質粒Bam H I/Kpn I雙酶切電泳圖Fig.3 Result of restriction enzymes

圖4 pET-22b（+）-apr表達質粒Bam H I/Kpn I雙酶切電泳圖Fig.4 Result of identification of recombinant toxins by Bam H I and Kpn I restriction enzymes

2.4 表達質粒的誘導表達及鑒定

將鑒定過的陽性克隆菌落接種到含氨芐青霉素（100 μg·mL-1）的 LB 液體培養基中，37 ℃ 150 mL搖菌過夜。分裝成5 mL相同LB液體培養基中，37℃下，搖菌80 min后，開始加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG，誘導后按1 h間隔，每次取0.5 mL，共取樣6次。將菌液樣品1 mL離心4 000 r·min-1，5 min，沉淀加入 200 μL SDS-PAGE 樣品緩沖液，于100℃水浴5 min，離心10 000 r·min-1，10 min，取上清加樣。采用8%的濃縮膠合10%的分離膠，電泳4.5 h。凝膠用考馬斯亮蘭R250染色。

SDS-PAGE電泳分析結果顯示：在37℃時IPTG誘導表達，重組質粒pET-22b（+）-apr出現了明顯的表達帶，其大小與理論預測分子質量55 ku相符，且1 mmol·L-1IPTG，誘導4 h時表達量達到最高（見圖5）。用1 mmol·L-1IPTG，在25℃過夜誘導表達，pET-22b（+）-apr是可溶性表達，且可溶性表達蛋白大部分定位在細胞質，少部分分泌到細胞周間質。

圖5 pET-22b(+)-apr不同時間內的誘導表達SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of expression in different time of pET-22b(+)-apr

2.5 表達產物的酶活性測定

將SDS-PAGE凝膠電泳鑒定為陽性的重組大腸桿菌菌株，接種于LB液體培養基中發酵培養24 h后，取1 mL發酵液作為粗酶液，測定其酶活，以轉進空載體的重組大腸桿菌菌株為空白對照菌。結果顯示重組大腸桿菌陽性菌的發酵產物具有的酶活為 19 500 U·mL-1。

3 討 論

目前，國內外多是采用商品蛋白酶水解和微生物發酵降解大豆蛋白制備抗氧化肽，用商品蛋白酶水解大豆蛋白雖然操作簡單、水解條件溫和，但成本高、水解產物有苦味，如應用到食品工業還需進行脫苦等的技術缺陷[14]；發酵法營養物濃度和微生物分布均勻，接種量小，產物純化相對簡單等優點[15]。但發酵時間長、不易控制。因此需要一種成本低，產量大的抗氧化肽制備技術。本試驗選用了枯草芽孢桿菌apr基因制備大豆蛋白肽，這與王芳選用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌發酵酶解豆粕粉，枯草芽孢桿菌相對于其他菌株有較強的蛋白利用能力的結論一致[16]。而且該種蛋白酶介導的酶解作用，具有產酶量高，靶位點特異和良好的發酵特性等特點，適合工業化應用。

為了提高本研究中構建的陽性克隆菌株的表達效率和質量，試驗同時比較了25和37℃時的蛋白酶的表達形式，優化誘導表達條件。結果表明，在25和37℃，誘導溫度對誘導的表達量并無顯著的影響，但對蛋白的表達形式影響很大。在25℃時以可溶性蛋白表達，37℃時以包涵體形式表達。這可能與25℃時細菌的生長周期較長，表達產物生成速度也較慢，有利于蛋白形成正確的空間構象有關，故表達形式為可溶性蛋白；在37℃時細菌生長快，表達產物生成快，來不及形成正確的空間構象就聚合在一起形成了包涵體蛋白[17]。一般說來，以包涵體形式表達的重組蛋白其表達量一般比較高。而且當溫度控制在37℃左右波動時，誘導表達的效率和誘導時間在一定范圍內正相關。另外，對于IPTG，在較大范圍內波動對誘導效果并無顯著影響[18]，所以基于本實驗室傳統經驗角度考慮采用 1 mol·L-1的IPTG終濃度。最后，從誘導的時間上分析，在本研究中建立的表達體系中超過4 h的長時間誘導是沒有必要的。綜上所述，通過優化表達的誘導條件，枯草芽孢桿菌apr基因工程菌能夠高效表達。

4 結論

本試驗采用分子生物學方法，構建了枯草芽孢桿菌apr基因工程菌。apr基因序列全長1 509 bp，誘導表達分子質量為55 ku的pET-22b（+）-apr融合蛋白，酶學活性測定為19 500 U·mL-1。枯草芽孢桿菌apr基因工程菌構建的成功對于下一步的工業上生產制備大豆抗氧化肽具有實際的指導意義。

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