殺蟲抗生素米爾貝乳油制劑的加工配方探討

王慧君，滑 雪，趙長山

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

米爾貝（Milbemycins）是從 Streptomyce hygroscopicus subsp.發(fā)酵產(chǎn)物中提取的一類十六元大環(huán)內(nèi)酯混合物[1-4]，根據(jù)該類化合物結(jié)構(gòu)中是否具有氫化苯并呋喃結(jié)構(gòu)，可將其分為α型和β型。其中α型化合物除了C13位上的糖苷配基外，與阿維菌素的結(jié)構(gòu)沒有根本區(qū)別[5]。三共（Sankyo）株式會社在1973年用未試驗棉紅蜘蛛進行新的殺蟲抗生素篩選時，發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵產(chǎn)物對多種害蟲有獨特的效果[6]。研究證明，米爾貝對農(nóng)業(yè)害蟲具有廣譜防治活性，1976年青木等申請了美國專利，主要是關(guān)于米爾貝殺蟲殺螨性[7]。該類化合物具有殺蟲、殺螨、驅(qū)蟲等廣泛的生物活性，且α型結(jié)構(gòu)的活性遠遠高于β型，故人們對該類化合物的研究主要集中在α型上[8-9]；在20世紀80年代中期，三共（Sankyo）株式會社發(fā)現(xiàn)的Milbemycin A3、Milbemycin A4較具代表性[9-10]，以A3和A4（3：7）的混合物作為商品制劑Milbeknock，于1990年最初在日本登記作為殺螨劑用于茶葉、茄子[11]，該種制劑國外有乳油、懸浮液和可濕性粉劑三種劑型[11-12]。當(dāng)前，米爾貝作為殺蟲抗生素已在日本、歐美等多個國家登記，并且作為安全、對環(huán)境友好的殺蟲殺螨劑被美國環(huán)保局推薦使用。殺蟲抗生素米爾貝被認為是目前最有前途的廣譜、高效、新型、抗蟲、無交叉抗性的生物殺蟲劑。鑒于我國尚未有米爾貝類殺蟲殺螨劑的登記注冊，農(nóng)業(yè)害蟲防治又需要像米爾貝這種高效、低毒、安全、環(huán)保的藥劑，因此本研究對米爾貝乳油制劑的配方進行了篩選，并對實驗室小樣進行質(zhì)量檢測及藥效試驗，以期得到合格制劑配方，并為實際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

米爾貝原藥（40%），淡黃色晶體，工業(yè)品；甲醇，液相色譜級，Span-80，天津永大試劑廠；二甲苯，乙酸乙酯，甲醇，溶劑油200#，Tween-80，哈爾濱新達化工廠；壬基酚聚氧乙烯醚類乳化劑系列 NP（NP4、NP7、NP10、NP15），聚氧乙烯蓖麻油乳化劑系列 EL（EL10、EL20、EL40、EL90），農(nóng)乳 500#，農(nóng)乳 600# 系列（600#A，600#B，600#C），工業(yè)品，遼陽奧克化學(xué)有限公司。光穩(wěn)定劑UV9、UV531、抗氧化劑1010、抗氧化劑1076、TBHQ、GW944、GW770，南京米蘭化工有限公司。

高效液相色譜，Waters公司；DT-102型自動界面張力儀，淄博華坤電子儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶劑的篩選

根據(jù)米爾貝在各種溶劑中的溶解度，選擇溶解度較大，外觀均勻透明，理化性質(zhì)穩(wěn)定，成本較低的溶劑。溶解度測定方法按照文獻[11]中介紹的方法進行。

1.2.2 乳化劑的篩選

乳化劑篩選方法按照張坤玲等方法進行[12]。其中 SPAN（HLB=4.3）與 TWEEN（HLB=15）設(shè)置系列比例使其HLB值分別為4.3、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0；用量占原藥-溶劑體系質(zhì)量10%，按《液體制劑》中介紹的方法評價乳化效果[11]。乳化劑組合選擇陰離子和非離子、非離子和非離子組合。

1.2.3 乳化劑含量的校正

有效成分含量、溶劑種類不變，將乳化劑含量預(yù)設(shè)為7%、8%、9%、10%、11%，配制乳油小樣。將各乳油小樣配制成10、20、50、100、200、400、800、1 500、3 000 mg·L-1的系列濃度，分別測定其表面張力，繪制濃度對數(shù)-表面張力圖，分析確定臨界膠束濃度[13]。

1.2.4 光穩(wěn)定劑的篩選

按照吳傳萬等方法進行光穩(wěn)定劑的篩選[14]。備選的光穩(wěn)定劑有7種，分別為UV9、UV531、抗氧化劑1010、抗氧化劑1076、TBHQ、GW944和GW770。

1.3 質(zhì)量檢測

有效成分含量檢測采用高效液相色譜法，色譜條件為，流動相：甲醇/水（V/V）=90/10；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：238 nm；pH、水分、冷熱貯穩(wěn)定性按照國家標(biāo)準(zhǔn)進行[15-18]。

1.4 5%米爾貝乳油對紅蜘蛛室內(nèi)活性測定

試驗設(shè)置5個處理，分別為5%米爾貝乳油稀釋30 000倍、40 000倍、50 000倍；1.8%阿維菌素稀釋10 000倍[19-21]，清水做空白對照，計算校正死亡率。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)用Excel 2003和DPSv10.05企業(yè)版軟件進行統(tǒng)計及方差分析、多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑的選擇

由表1可知，備選的四種溶劑中，對原藥的溶解度甲醇最大，乙酸乙酯和溶劑油200#居中，二甲苯最小，但均遠遠超過配方要求的5%的溶解度。原藥-溶劑體系外觀均能呈單相油狀，無沉淀，無分層。考慮到制劑成本及對環(huán)境的安全性，不能選擇甲醇作為溶劑，而溶解度稍小的乙酸乙酯成本較高、易揮發(fā)，二甲苯作為芳香性溶劑對環(huán)境影響較大，故選擇輕質(zhì)烷烴混合物溶劑油200#作為最佳溶劑。

2.2 乳化劑的選擇

由表2可知，HLB值在13～14范圍內(nèi)，油體系的乳化效果最好。經(jīng)細化SPAN-TWEEN的比例，得到13.2、13.4、13.6、13.8四個值，考察乳化效果最終確定最佳HLB值為13.8，此值即可看做是油體系的HLB值。

配方篩選中供試乳化劑共15種，HLB值等于13.8的乳化劑組合共41個組合（農(nóng)乳500#與600#B、600#C、NP15、EL90、TWEEN20、 TWEEN80分別組合，EL40與600#A、600#B、600#C、NP15、TWEEN20、TWEEN80分別組合，EL90與 NP4、NP7、NP10、SPAN80分別組合，NP15與 EL10、EL20、SPAN80分別組合，TWEEN20與 NP4、NP7、SPAN80、EL10、EL20分別組合，TWEEN80與NP4、NP7、EL10、EL20分別組合，600#A與NP10 組合，600#B 與 NP4、NP7、NP10、SPAN80、EL10、EL20分別組合，600#C分別與NP4、NP7、NP10、SPAN80、EL10、EL20分別組合）。按上述方法評價乳化效果，結(jié)果表明，41個乳化劑組合中EL10、EL20、EL90、NP7、NP10、600A 在組合中都表現(xiàn)出較好的乳化效果，其中NP10與EL90（HLB=13.8時質(zhì)量比為86：14）組合最好，確定該組合為5%米爾貝乳油的最佳乳化劑。

表1 米爾貝原藥在各供試溶劑中的溶解度Table 1 Solubility of Milbemycin in solvent

表2 SPAN-TWEEN按照不同比例配比作為乳化劑時的乳化效果Table 2 Emulsify effectiveness of active compound in different ratio of SPAN-TWEEN

2.3 乳化劑含量的確定

5%米爾貝乳油小樣中乳化劑在7%～11%時均能達到乳化效果合格，含7%的乳化劑時達到臨界膠束濃度時藥液濃度為50 mg·L-1，含量在8%～11%時臨界膠束濃度為100 mg·L-1，結(jié)果見表3，由此說明乳化劑含量調(diào)整至8%仍可達到預(yù)設(shè)的10%乳化劑的乳化效果，且體系穩(wěn)定。

2.4 光穩(wěn)定劑篩選結(jié)果

按照1.3中有效成分含量測定方法，分別測定各種光穩(wěn)定劑對米爾貝光分解的抑制作用，由表4可知，備選的7種光穩(wěn)定劑提高24 h的殘留率均在40%以上，通過方差分析，新復(fù)極差法多重比較，添加抗氧化劑1010與UV9、UV531在紫外燈光照處理8 h后的差異不顯著，處理12～24 h時抗氧化劑1010對米爾貝分解的抑制作用明顯優(yōu)于其他穩(wěn)定劑，添加后比不添加的殘留率高出60%，故確定抗氧化劑1010為最佳穩(wěn)定劑，含量占乳油質(zhì)量的1%。

2.5 5%米爾貝乳油最終配方

有效成分含量占制劑總量5%（質(zhì)量分數(shù)，下同），選擇乳化劑NP10與乳化劑EL90的組合，含量分別為6.8%和1.2%，抗氧化劑1010含量1%，乙酸乙酯2%，余量溶劑油200#補足。

2.6 質(zhì)量檢測結(jié)果

5%米爾貝乳油的質(zhì)量檢測結(jié)果如下：外觀均一，單相油狀，有效成分≥5%，水分含量≤0.5%，pH值為4.19，冷熱貯穩(wěn)定性合格。

2.7 5%米爾貝乳油對紅蜘蛛室內(nèi)藥效測定

由表5可知，用5%米爾貝乳油的50 000倍液防治紅蜘蛛，與1.8%阿維菌素乳油10 000倍液的防效相當(dāng)，且用藥量明顯少于1.8%阿維菌素。因此，5%米爾貝乳油適合防治紅蜘蛛。

表3 各乳化劑含量的臨界膠束濃度Table 3 Critical micelle concentration（CMC）of various emulsifiers content

表4 紫外燈光照下不同光穩(wěn)定劑對米爾貝分解的抑制作用Table 4 According to different light stabilizer inhibit to Milbemycin under the UV light

表5 5%米爾貝乳油及其對照藥劑對紅蜘蛛室內(nèi)生物測定結(jié)果Table 5 Results from laboratory bioassay of 5%Milbemycin and contrast acaricide

3 討論與結(jié)論

米爾貝原藥是一種淡黃色固體，能溶于多種有機溶劑，溶解度較大，適合加工成乳油制劑。通過對溶劑、乳化劑、光穩(wěn)定劑的篩選，確定最終配方：有效成分含量占5%，選擇乳化劑NP10與乳化劑EL90的組合，含量分別為6.8%和1.2%，抗氧化劑1010含量1%，助溶劑乙酸乙酯2%，余量溶劑油200#補足。質(zhì)量檢測結(jié)果表明，該配方各項質(zhì)量控制項目均能達到合格標(biāo)準(zhǔn)，制劑外觀清亮無沉淀或懸浮物，均相油體；冷熱貯分解率符合國家乳油標(biāo)準(zhǔn)；含水量小于0.5%；揮發(fā)率小于30%。

對紅蜘蛛的藥效試驗結(jié)果表明，5%米爾貝乳油對紅蜘蛛具有較好的防效，與1.8%阿維菌素乳油相比殺螨效果相當(dāng)，用藥量更少，適合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)防治紅蜘蛛。因此，本研究將殺蟲抗生素米爾貝加工為乳油制劑，仍具有一定的開發(fā)和生產(chǎn)意義。同時，隨著人們環(huán)境意識的加強，替代乳油的環(huán)保劑型將逐步發(fā)展起來，并將成為今后化學(xué)防治的主要趨勢，乳油配方的研究將成為微乳劑、水乳劑、微膠囊懸浮劑等劑型的研究基礎(chǔ)。

[1]Mishima H,Ide J,Muramatsu S,et al.Milbemycins,a new family of macrolide antibiotics structure determination of Milbemycins[J].Journal of Antibiotics,1983(8)∶980-990.

[2]Okazaki T,Ono M.Milbemycins,a new family of macrolide antibiotics∶producing organism and its mutants[J].J Antibiotics,1983,36∶438-441.

[3]Zhang X L,Chen Z,Li M,et al.Construction of ivermectin producer by domain swaps of avermectin polyketide synthase in Streptomyces avermitilis[J].Microbiol Biotechnol,2006,72∶986-994.

[4]Chamberland,Lee S,Lomovskaya M,et al.Fungal efflux pump inhibitors∶US,6495591 B1[S].2002-12-17.

[5]袁德凱,趙衛(wèi)光,李正名.Milbemycins的結(jié)構(gòu)修飾[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報,2003,5(1)∶1-11.

[6]Aoki,Atsushi,Fukuda,et al.Antibiotic substances B-41,their production and their use as insecticides and acaricides∶US,3998699[P].1975-05-01.

[7]Aoki,Atsushi,Fukuda,et al.Antibiotic substances∶US,3950360[P].1976-04-13.

[8]Fisher,Michael H,Tolman R L.Carbohydrate derivatives of milbemycin and processes therefor∶United States,4134973[P].1979-01-16.

[9]Amano H,Ishi Y,Kobori Y.Pesticide susceptibility of two dominant Phytoseiidmites,Neoseiuluscalifornicus andN.womersleyi,inconventional Japanese fruit orchards(Gamasina:phytoseiidae)[J].J Acarol Soc Jpn,2004,13(1)∶65-70.

[10]Pluschkell U,Horoeitz A R,Ishaaya I.Effect of Milbemectin on the sweetpotato whitefly,Bemisia tabaci[J].Phytoparasitica,1999,27(3)∶183-191.

[11]郭武棣.液體制劑[M].3版.北京∶化學(xué)工業(yè)出版社,2003∶281.

[12]張坤玲,李瑞珍,盧玉妹,等.HLB值與乳化劑的選擇[J].石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2004,16(6)∶20-22.

[13]顧中言,許小龍,韓麗娟.殺蟲劑藥液中表面活性劑的臨界膠束濃度及表面張力[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2002,18(2)∶89-93.

[14]吳傳萬,杜小鳳,王偉中,等.阿維菌素光分解及其光穩(wěn)定劑的篩選[J].農(nóng)藥,2006,45(12)∶828-831.

[15]全國文獻工作標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會第七分委員會.GB/T 19137-2003中國標(biāo)準(zhǔn)書號[S].北京∶中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.

[16]全國文獻工作標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會第七分委員會.GB/T 19136-2003中國標(biāo)準(zhǔn)書號[S].北京∶中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.

[17]全國文獻工作標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會第七分委員會.GB/T 1600-2001中國標(biāo)準(zhǔn)書號[S].北京∶中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2001.

[18]全國文獻工作標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會第七分委員會.GB/T 1601-93中國標(biāo)準(zhǔn)書號[S].北京∶中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,1993.

[19]孟和生.兩種生測方法對殺螨劑毒力測定結(jié)果的影響比較[J].植物保護,2002,28(3)∶49-51.

[20]黃素青,徐漢虹,曾東強,等.農(nóng)田害螨的幾種生物測定方法[J].植物保護,2005,31(1)∶79-81.

[21]錢瑩哲,曾水云,林開春.阿維菌素3種劑型殺蟲活性比較[J].湖北植保,2006(6)∶32-33.