乙酰丁香酮濃度和共培養(yǎng)pH對(duì)大豆再生頻率的影響

武小霞，李 靜，王志坤，劉珊珊，李海燕，馬 永，李文濱

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大豆生物學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.七臺(tái)河市新興區(qū)長興鄉(xiāng)人民政府農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，黑龍江 七臺(tái)河 154532）

大豆是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化植物，主要原因是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織分化再生植株較困難，再生頻率相對(duì)較高的再生系統(tǒng)還不能和現(xiàn)有的植物轉(zhuǎn)化方法很好的結(jié)合。大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)中以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為主導(dǎo)且應(yīng)用最為廣泛[1]。在大豆的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，影響轉(zhuǎn)化效率的條件很多，其中在共培養(yǎng)階段加入乙酰丁香酮的濃度和pH對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大的影響。大豆雖然是雙子葉植物，但與其他作物相比，它不易受農(nóng)桿菌感染，不同的大豆基因型對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性存在差異[2-7]。1988年，Hinchee等首次報(bào)道了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)組織，并獲得轉(zhuǎn)基因植株[8]。目前最常用、最成熟的農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)基因的方法就是在Hinchee等的工作基礎(chǔ)上改良的子葉節(jié)法[9-11]。本研究在農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)基因的過程中對(duì)乙酰丁香酮濃度和pH對(duì)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的影響進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以篩選得到的大豆基因型黑農(nóng)35，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，由無菌苗得到的子葉節(jié)為農(nóng)桿菌浸染的外植體。

1.2 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichiacoli）所用菌株為DH5α，根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株為LBA4404（RifR，StrR，KmR），均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供[12]。質(zhì)粒pSPUD5由美國密切根州立大學(xué)提供，圖譜見圖1，帶有選擇標(biāo)記基因NptⅡ，目的基因cryⅤ抗蟲基因，該質(zhì)粒帶有35S起動(dòng)子和NOS終止子。

圖1 質(zhì)粒pSPUD5圖譜Fig.1 Map of pSPUD5

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

以對(duì)農(nóng)桿菌最敏感的大豆品種為試驗(yàn)材料，對(duì)影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的兩個(gè)主要因素（共培養(yǎng)基中AS濃度、共培養(yǎng)pH）進(jìn)行2因素5水平的試驗(yàn)。以各因素水平的抗性芽率的平均值（K）為指標(biāo)，確定各因素的最適水平。再通過各因素各水平的極差分析（R），確定各因素影響主次順序。

表1 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素與水平Table 1 Factors and levels of influencing Agrobacteriummediated transformation efficiency

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酰丁香酮（Acetosyringone,AS）對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

乙酰丁香酮（AS）是影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的重要因子。乙酰丁香酮的使用使許多難轉(zhuǎn)化植物的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化頻率大幅度提高，甚至使以前不能被農(nóng)桿菌侵染的植物也可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[13]。為了明確大豆轉(zhuǎn)化的適宜乙酰丁香酮濃度，以大豆品種黑農(nóng)35的子葉節(jié)為外植體，用含有質(zhì)粒pSPUD5的農(nóng)桿菌LBA4404進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的乙酰丁香酮濃度設(shè)置5個(gè)水平，0、50、100、150 和 200 μmol·L-1；并在培養(yǎng)基中加入20 mmol·L-1MES作為pH緩沖劑。用產(chǎn)生抗性愈傷的外植體占總外植體的百分率表示轉(zhuǎn)化頻率[14]。由表2、3可知，隨著乙酰丁香酮濃度的升高，抗性芽率也逐漸升高，50～150 μmol·L-1的乙酰丁香酮均顯著提高大豆的轉(zhuǎn)化頻率。但濃度不宜過高，濃度過高反而降低轉(zhuǎn)化頻率（200 μmol·L-1及以上），最佳濃度為100 μmol·L-1；由表4可以看出，乙酰丁香酮單因素的F值達(dá)到極顯著水平。說明在共培養(yǎng)階段的乙酰丁香酮濃度對(duì)大豆轉(zhuǎn)化頻率有明顯影響。

表2 乙酰丁香酮的（AS）濃度和pH對(duì)大豆轉(zhuǎn)化頻率的影響Table 2 Effect of acetosyringone and pH on transformation efficiency of soybean

表3 不同乙酰丁香酮(AS)濃度和pH的平均轉(zhuǎn)化頻率及其差異顯著性Table 3 Average transformation efficiency and significant difference of AS and pH

表4 乙酰丁香酮（AS）濃度和pH對(duì)大豆轉(zhuǎn)化頻率影響的方差分析Table 4 Variance analysis of effect of acetosyringone and pH on the transformation efficiency of soybean

2.2 pH對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

pH也是影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的重要因子。共培養(yǎng)培養(yǎng)基中pH的大小嚴(yán)重影響農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率。為了明確大豆轉(zhuǎn)化的適宜pH，以大豆品種黑農(nóng)35的子葉節(jié)為外植體，用含有質(zhì)粒pSPUD5的農(nóng)桿菌LBA4404進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH設(shè)置5個(gè)水平，5.2、5.4、5.6、5.8和6.0，并在培養(yǎng)基中加入20 mmol·L-1MES作為pH緩沖劑。用產(chǎn)生抗性愈傷的外植體占總外植體的百分率表示轉(zhuǎn)化頻率[14]，通過表2、3可以看出，pH等于5.2和高于（或等于）5.8時(shí)，轉(zhuǎn)化頻率極顯著地下降。因此確定pH以5.4～5.6為宜。從表4可以看出，pH單因素的F值均達(dá)到極顯著水平，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的pH對(duì)大豆轉(zhuǎn)化頻率有明顯影響。

3 討論與結(jié)論

越來越多的研究表明，在大豆轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮可以部分克服農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)化的組織特異性，是農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)化成功的重要因素[16-17]。本研究在農(nóng)桿菌侵染后的共培養(yǎng)階段，加入了不同濃度的乙酰丁香酮，同時(shí)調(diào)節(jié)pH，發(fā)現(xiàn)乙酰丁香酮和pH均對(duì)大豆轉(zhuǎn)化頻率有明顯影響。pH等于5.2和高于（或等于）5.8時(shí)，轉(zhuǎn)化頻率極顯著地下降。因此 pH 以 5.4～5.6 為宜。50～200 μmol·L-1的乙酰丁香酮均顯著提高大豆的轉(zhuǎn)化頻率，但濃度不宜過高，濃度過高反而降低轉(zhuǎn)化頻率，最佳濃度為100 μmol·L-1。可能是在培養(yǎng)基中加入的乙酰丁香酮能夠在一定程度上克服大豆對(duì)農(nóng)桿菌敏感性差的障礙。

結(jié)果表明，大豆轉(zhuǎn)化過程中pH以5.4～5.6為宜。50～200 μmol·L-1的乙酰丁香酮均顯著提高大豆的轉(zhuǎn)化頻率，最佳濃度為 100 μmol·L-1。

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