人β防御素-2抗唾液支原體活性研究

王玉愛 劉志杰

β-防御素-2(hBD-2)是近年發現的一類由中性粒細胞和上皮細胞產生的，富含半胱氨酸的陽離子低分子肽類，它先天性免疫中保護宿主免受多種病原微生物引起感染中起關鍵性作用，如革蘭陰性和陽性細菌、酵母菌和一些有包膜病毒[1]。唾液支原體是一種與人類牙周病密切相關的病原體[2]，目前hBD-2在抵抗唾液支原體感染中的作用還不是完全清楚。本研究試圖通過檢測hBD-2在上皮細胞中的表達以及是否對唾液支原體具有抗菌作用來探討其防御機制。

1 材料和方法

1.1 試劑與菌株

hBD-2購自Merk。牙齦上皮細胞(HGEC)的制備按照有關參考文獻的方法進行[3]，唾液支原體來自ATCC(ATCC 23064)。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購自大連寶生物公司，其余試劑均為分析純產品。

1.2 抗菌活性檢測

唾液支原體(ATCC23064)于含有10%馬血清、1%酵母浸液，1%精氨酸、1000u青霉素的PPLO肉湯培養基(pH7.0)中培養。當pH值上升一個單位，15000g離心15min，無菌PBS洗滌3次并用含有1%明膠的Hank’s液重懸浮。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)

收集HGEC細胞，按5×104/孔接種至包被有Ⅰ型膠原的6孔板中。待其生長2d后加入上述菌液(使用時稀釋10倍)混合培養培養。收集細胞在4℃1500g離心5分鐘得到沉淀。沉淀物用來提取RNA，用AMV逆轉錄酶XL和TaKaRa Ex Taq聚合酶依照說明書操作進行cDNA合成和逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)(Takara)。人hBD-2和GAPDH(用做內對照)的引物由上海生工合成，序列分別如下[4]：hBD-2：上游：5’-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3’，下游5’-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3’；GAPDH：上游：5’-GTC AAG GCT GAG AAC GGG AA-3’，下游5’-GCT TCA CCA CCT TCT TGA TG-3’。產物長度分別為254bp和613bp。具體反應條件如下：94℃1min，63℃1min，72℃1min，共33個循環。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳用溴化乙錠染色并經凝膠成像系統成像。

2 結果

2.1 唾液支原體能誘導HGEC細胞表達hBD-2mRNA

圖1所示，唾液支原體感染后能誘導HGEC細胞表達hBD-2 mRNA。而β-actin的無明顯變化。

2.2 hBD-2的抗菌活性

hBD-2的抗菌活性如圖2所示，hBD-2在1～4μM呈劑量依賴性，在4μM濃度時，唾液支原體數量比對照物抑菌率達86%。

3 討論

由于長期濫用抗菌藥物，細菌耐藥性問題已經成為醫學界的一大難題。目前尋求天然抗菌活性藥物已成為當今研究的熱點。hBD-2是一類可誘導表達的人類抗微生物多肽，正常情況下在皮膚、腎臟、鼻黏膜等組織中甚少表達，而在感染和炎癥狀態下才大量表達，本研究結果顯示，唾液支原體感染后，能誘導HGEC細胞表達hBD-2mRNA。抑菌結果可以看出，在4μM濃度時，對唾液支原體的抑制率將近達90%。以上結果說明其在人體的防御體系中可能發揮著一定的作用：感染可明顯誘導或增強hBD-2的表達水平，hBD-2不僅可以直接抵抗病原微生物的感染，而且還可以通過啟動獲得性免疫系統來提高機體抵抗微生物感染的免疫水平。

關于hBD-2抗微生物的機制主要是誘導微生物細胞膜上形成孔道而殺傷靶細菌。大多數原核生物胞膜帶負電荷，而正常的真核細胞由于細胞骨架系統高度發達，膽固醇含量較高，負電荷較少，因而不與hBD-2發生作用。此外，hBD-2的抗微生物活性還受到某些因素的影響，如環境中的鹽濃度和離子種類等。由于hBD-2殺菌具有獨特性，不易耐藥，因此對它的研究及應用已成為生物制藥領域中的熱點，將對新疫苗的發展起到重要作用。

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[3]Mahanonda R,Sa-Ard-Iam N,Eksomtramate M,et al.Cigarette smoke extract modulates human beta-defensin-2 and interleukin-8 expression in human gingival epithelial cells[J].J Periodontal Res,2009 Aug,44(4):557-564.

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