黑穗醋栗花中RNA提取方法的比較研究

趙 慧，李興國，于澤源

（東北農業大學園藝學院，哈爾濱 150030）

從植物中提取較高質量的總RNA是順利進行基因表達模式，克隆基因等各種分子生物學研究的基礎。常用的RNA提取方法有異硫氰酸胍法[1]、鹽酸胍法[2]、苯酚法[3]、SDS 法[4]、CTAB 法[5]、LiCi尿素法[6]、熱硼酸法[7]、改良Bugos法[8-9]等。植物組織中的多酚、多糖和蛋白質以及其他代謝物質均能影響RNA的提取[10]。由于不同植物不同組織，甚至同一植物不同發育期，植物所含化學成分不同，影響植物RNA提取的因素亦不同，因此應該針對植物材料的具體特點選擇適宜的總RNA提取方法。黑穗醋栗是虎耳草科茶 藨 子 屬小灌木，從當前的研究來看，關于黑穗醋栗分子生物學領域的研究報道較少，本研究的宗旨是篩選出適合黑穗醋栗花中總RNA的提取方法，為黑穗醋栗分子生物學領域的研究提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

在黑穗醋栗（布勞得）盛花期，采摘完整的花朵，迅速投入液氮中冷凍備用。

1.1.2 試劑

CTAB、DEPC、SDS、氯化鋰、β-巰基乙醇、醋酸鈉、EDTA、Tris苯酚等購自上海生物工程公司；瓊脂糖為西班牙原裝；DNaseⅠ、RNase抑制劑、反轉錄試劑盒等購于PROMEGA公司；其他的化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 試驗耗材及儀器

所用試劑瓶和塑料耗材均預先用0.1%DEPC水處理24 h以上，50～60℃烘干，并高壓滅菌20 min。研缽150℃烘干4 h后低溫冷凍，所需試劑均用0.1%DEPC水配制，并濕熱滅菌20 min避免RNase污染。儀器為瓊脂糖水平電泳槽，瓊脂糖電泳儀，高速低溫冷凍離心機，電子天平，超低溫冰箱，電熱恒溫水浴鍋，漩渦振蕩器，超凈工作臺等。

1.2 方法

1.2.1 CTAB法

參照溫鵬飛葡萄果皮中RNA的提取[5]。

1.2.2 植物RNA提取

RNA提取試劑盒（天澤公司植物RNA out編號3080-10的試劑盒，略有改動）。

取0.2 g樣品液氮研磨成粉后迅速放入預冷離心管中后加入1 mL A溶液勻漿，加入0.3 mL溶液B和0.2 mL氯仿。充分振蕩混勻。12 000 r·min-1離心3 min后移入新的離心管中，加入0.5 mL溶液C和0.2 mL氯仿充分振蕩混勻。12 000 r·min-1離心3 min后移入新的離心管中，加入1/2體積的溶液D，振蕩混勻后離心20 min，棄上清75%乙醇洗滌2次，沉淀用40 μL DEPC水溶解待用。

1.2.3 硼砂-SDS法

參照許平等總RNA的提取[11]，略有改動。1.5 mL離心管中加入0.6 mL SDS提取液，0.06 mL β-巰基乙醇，0.4 mL Tris苯酚和0.3 mL氯仿，取樣品0.2 g液氮研磨后迅速加入離心管中，用漩渦振 蕩 器 振 蕩 約 3 min，10 000 r·min-1離 心5 min，取上清，加入0.3 mL Tris苯酚和0.3 mL氯仿，用漩渦振蕩器劇烈振蕩2 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清。等體積氯仿重復抽提一次取上清，加入等體積10 mol·L-1氯化鋰和1/2體積的無水乙醇，冰浴10 min，1 000 r·min-1離心10 min，沉淀RNA。沉淀加300 μL DEPC水，30 μL 3 mol·L-1醋酸鈉和 900 μL無水乙醇，冰浴 10 min，12 000 r·min-1離心 10 min，棄上清，75%乙醇洗滌2次，沉淀用40 μL DEPC水溶解待用。

1.2.4 Trizol法

取0.2 g樣品液氮速凍研磨后，迅速加入1 mL Trizol試劑，充分搖勻，室溫放置5 min，加入0.2 mL氯仿：異戊醇（24：1）劇烈震蕩15 s，室溫放置2 min。4℃ 12 000 r·min-1離心 15 min，取上清，棄沉淀，上清轉入新離心管中。加入0.5 mL異丙醇，混勻，室溫放置10 min。4℃12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌2次，40 μL DEPC水溶解待用。

1.2.5 合成

按照PROMEGA反轉錄試劑盒的說明對硼砂-SDS法提取的總RNA進行反轉錄，方法如下：在tube-1 中 加 入 總 RNA，8.0 μL 和 oligo dT（20 μmol·L-1）2.0 μL，70 ℃水浴 5 min 后直放到 42 ℃水浴1～2 min。在200 μL tube-2中加入下列成分：5.0 μL，M-MLV（5×Buffer）；1.25 μL，10 mol·L-1d NTP mix；1.0 μL，rRNAsin（40 U）；1.0 μL，MMLVRT（200 U）；4.75 μL，DEPC 和 tube-1 體系相加為25 μL。42℃水浴1～2 min。保持42℃，兩管混合42℃，60 min；70℃，15 min。最后-20℃保存。

2 結果與分析

2.1 凝膠電泳分析

2.1.1 不同提取方法的黑穗醋栗花朵RNA樣品的凝膠電泳分析

取 3 μL RNA 樣品與 2 μL 6×Loading buffer混合后進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為120 V，電流100 mA，功率256 W的條件下電泳15 min，在紫外凝膠成像系統上觀察RNA條帶的清晰度和完整性并拍照。可見利用CTAB提取的總RNA可以看出18S和28S條帶，但是降解嚴重（見圖1-A）。Plant out RNA試劑盒瓊脂糖凝膠電泳檢測后呈現兩條清晰的條帶，分別為28S和18S RNA，二者亮度比約為2：1，條帶無明顯降解（見圖1-B）。利用硼砂-SDS法提取的RNA，28S和18S兩條帶型清楚，而且28S rRNA無論在質量和亮度上均是18S rRNA的兩倍。兩條帶之間無彌散現象，排除RNase污染，未發生明顯降解現象（見圖1-C）。Trizol法提取黑穗醋栗花的總RNA無任何條帶，表明該方法不適用于黑穗醋栗花總RNA提取（見圖1-D）。

2.1.2 cDNA檢測

進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為120 V，電流100 mA，功率256 W的條件下電泳30 min，在紫外凝膠成像系統上觀察cDNA條帶并拍照。反轉錄可得500～1 000 bp之間的彌散cDNA條帶。

圖1 黑穗醋栗花朵總RNA電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of blackcurrant flower total RNA isolated with different methods

圖2 反轉錄Fig.2 cDNA

2.2 RNA樣品的質量檢測分析

紫外分光光度計定量測定和純度分析見表1。取2 μLRNA樣品稀釋50倍，在紫外分光光度計測定230、260和280 nm波長下OD值，計算出OD260/OD280和OD260/OD230的值以確定提取的黑穗醋栗RNA的純度。

通過如下公式計算產率：

RNA 樣品的產率（μg·g-1）=OD260×N（樣品稀釋倍數）×40（μg·mL-1）×V（mL）/樣品重（g）。

表1 不同提取方法得到黑穗醋栗花朵中總RNA的OD值和得率Table 1 OD value and yield of the blackcurrant total flower RNA isolated with different methods

排除Trizol法未提取出黑穗醋栗花朵中的RNA，分別對其他3種方法所得的RNA的OD值進行比較，CTAB法所得的RNA的純度較低，D260/D280為1.62，植物RNA提取試劑盒法提取的RNA純度較高，OD260/OD280為1.9，硼砂-SDS法提取的純度最高，OD260/OD280達到2.06，這說明用此方法提取的總RNA純度高，經計算得出總RNA產率達 61.60 μg·g-1，說明硼砂-SDS法提取的黑穗醋栗花朵中的總RNA可用于分子克隆試驗研究。

綜合純度，完整性和產量等因素，認為硼砂-SDS法最適合黑穗醋栗花朵中總RNA的提取。其余方法提取出的總RNA OD260/OD280和OD260/OD230的值都小于2.0，說明存在蛋白質、酚類、多糖的污染，總 RNA 得率不足 60 μg·g-1。

3 討論

RNA提取的影響因素有很多，不同植物或者同一植物不同器官的組分和含量就有很大的差異。酚類化合物、多糖、蛋白質和未知次級代謝產物是影響植物組織RNA提取的幾個主要干擾因素[12]。近年來有關木本植物RNA提取的方法有很多的文獻報道[10,13-15]，但是在植物材料勻漿時，這些富含酚類物質會釋放出來，氧化后使勻漿液變為褐色，并隨氧化程度的增加而加深，這一現象被稱為褐化效應（Browning effect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩定地結合，從而影響RNA的分離純化。黑穗醋栗花朵和其他的木本植物相似，體內含有較多的次級代謝物質，嚴重影響RNA的提取，因此去除酚類化合物是該樣品RNA提取的一關鍵因素。

常用的RNA提取方法CTAB法很適合于糖類含量高[5]，富含酚類化合物多的樣品[16]，但試驗發現CTAB法提取的時間較長，雖然可以提取出RNA，但該方法操作復雜繁瑣，需2 d才能完成而且降解嚴重。Trizol提取過程簡單方便，適用于提取很多種植物葉片的RNA，但是卻不適合去除次生代謝物含量高的樣品，在黑穗醋栗的花朵中沒有明顯的效果，不適合該種樣品的RNA提取。而Plant out RNA試劑盒用時較短，但純度較SDS法低，且價格相對昂貴。

4 結論

硼砂-SDS法，結合了各種方法的優點，用硼砂取代Tris-HCL，克服了Tris對DEPC的敏感，無法用DEPC處理的缺憾。其次利用高鹽LiCl可以選擇沉淀總RNA使部分多糖留在溶液中而不隨RNA沉淀下來，這樣極大地降低了沉淀中多糖的含量。而試驗中SDS、氯仿等又是蛋白質變性劑，可以明顯的使RNase喪失活性[11]。并且硼砂-SDS法試驗成本較低，試劑配制簡單。可為其他果樹花期次級代謝物含量較高的花朵的總RNA提取提供參考。

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