霍爾多巴吉白鵝小鵝瘟病毒的分離與鑒定

董 浩,馬 磊,單曉楓,胡桂學

(1.吉林農業大學生命科學學院,吉林 長春 130118;2.吉林農業大學動物科學技術學院,吉林 長春 130118)

小鵝瘟即鵝的細小病毒病(GPV),又稱Derzsy′s病,是雛鵝和雛番鴨的一種急性或亞急性敗血性傳染病,主要侵害3～20日齡雛鵝和雛番鴨,以出血性、纖維素性、滲出性腸炎為主要特征。該病傳染快,發病率和死亡率高,是嚴重危害養鵝業的重要傳染病之一。

近幾年,吉林省多個地區的鵝業公司從匈牙利引進霍爾多巴吉白鵝種蛋進行孵化,擴充商品鵝資源。霍爾多巴吉白鵝具有個體大、體質健壯、抗病力強,可供多次活體拔毛,產絨率高、羽絨品質好,與當地普通白鵝相比具有明顯的優勢。本試驗是在吉林省某鵝廠病死的霍爾多巴吉雛鵝體內進行采樣鑒定,以確定其病因。

1 材料與方法

1.1 病料與鵝胚 病料取自吉林省某鵝廠10日齡霍爾多巴吉病死雛鵝組織;10日齡鵝胚由吉林省獸醫研究所提供。

1.2 主要試劑與工具酶 小鵝瘟標準陽性血清由本實驗室收藏;Tag酶,PCR相關試劑盒,膠回收試劑盒均購于TaKaRa(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.3 病毒分離 無菌采集雛鵝肝、脾、胰腺等組織,剪碎,十字勻漿器研磨,以生理鹽水制成1∶1勻漿;低溫凍融3次,加雙抗1000 IU(μg),37℃感做30 min;10000 r/min離心20 min,取上清液待檢。取9～11日齡鵝胚,劃蛋,打孔,取處理好的上清液接種0.2 mL/枚,封孔,37℃孵化。孵化期間每8 h觀察1次,棄去24 h內死亡鵝胚,24 h后死亡的以及5 d后仍未死的鵝胚取出4℃保存。將保存的致死鵝胚和未死亡鵝胚無菌操作收集鵝胚尿囊液,-70℃保存備用。

1.4 病毒的電鏡觀察 取鵝胚尿囊液,12000 r/min離心10 min,取上清液置于銅網上,2%磷鎢酸負染1～2min,電鏡觀察并照相。

1.5 小鵝瘟病毒的PCR檢測

1.5.1 引物的設計 根據鵝細小病毒基因序列(Gen Bank登錄號為GPU25749)設計并合成了1對引物P1/P2,擴增 GPV VP3基因片段 375 bp,由大連TaKaRa公司合成[1]。

P1:5′-CCAAGCTACAACAACCACATCTAC-3′;P2:5′-CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC-3′

1.5.2 目的基因的擴增 以待檢病毒鵝胚尿囊液為模板,以P 1、P2為引物,進行PCR擴增目的基因。PCR反應體系如下:10×Ex Taq Buffer 2.5μL,P1(20 pmol/μL)0.5 μL,P2(20 pmol/μL)0.5 μL,dNTP 2μL,模板DNA 2.5μL,四餾水 16.5μL,Ex TaqTMDNA聚合酶0.5μL,PCR反應條件為:95℃預變性 5 min,94℃變性 1 min、54℃退火 1 min、72℃延伸2 min,共30個循環;最后72℃徹底延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 ELD50的檢測 取1.3分離的病毒尿囊液,進行10倍系列稀釋,并加入適量抗生素,過濾除菌。按0.2 m L/胚的接種量進行尿囊腔接種,每個稀釋度接種6枚鵝胚,37℃孵育7 d。記錄每個稀釋度的死胚數。按Reed和Muench法[2]計算ELD50。

1.7 瓊脂擴散試驗[3]瓊脂平板制作按參考文獻[3]配制,打孔、封底。中心孔加入抗GPV標準陽性血清,周圍孔分別加入接病料后的待測鵝胚尿囊液,以及空白對照和新城疫病毒陰性對照,濕盒37℃孵育18～36 h,觀察試驗結果。

2 結果

2.1 病毒分離結果 接種病料后鵝胚絨毛尿囊膜增厚,胚胎充血,翅膀、胸部、背部和頭部均有出血點。大多數鵝胚死亡時間為3～5 d。

2.2 電鏡觀察結果 由電鏡負染結果可知,病毒粒子直徑約為20～22 nm左右,無囊膜,呈圓形或多角形,具有典型的鵝細小病毒特征。

2.3 PCR擴增結果 對樣品進行PCR擴增,經過瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下可見375 bp左右大小的片段,見圖1。

2.4 ELD50測定結果 病毒的ELD50結果見表1,按 Reed和Muench法計算 ELD50。

根據表1,得到A株的ELD50:距離比值=(76.9-50)/(76.9-33.3)=0.62;lg ELD50=-5+0.62×(-1)=-5.62;ELD50=10-5.62/0.2 m L。

圖1 PCR擴增結果

表1 A株ELD50的測定結果

2.5 瓊脂擴散試驗結果 待檢病毒與GPV標準陽性血清出現比較清晰的沉淀線,而空白對照和新城疫病毒陰性對照均未出現沉淀線。

3 討論

本次試驗分離到的病毒株可以使鵝胚產生特征性病變并致死,通過電鏡觀察、PCR檢測、血清學檢查,均表明該病毒具有小鵝瘟病毒的典型特征,從而確認所分離到的病毒為小鵝瘟病毒。ELD50的測定結果為10-5.62/0.2 mL,與其他地區相關報道的小鵝瘟病毒的毒力相比要略高一些,這也正說明了小鵝瘟毒力的多變,對預防和治療都增加了不小難度[4]。

本次發病的鵝群為霍爾多巴吉白鵝,此品種白鵝從匈牙利以種蛋形式引進我省,此次小鵝瘟病毒來源尚不能確定,種蛋帶毒的可能也是存在的,需要進一步檢驗。

[1] 胡桂學,高光,鄒嘯環,等.小鵝瘟病毒分離與初步鑒定[J].經濟動物學報,2002,6(2):411-433.

[2] 李桂霞,劉勝旺,孔憲剛,等.鵝細小病毒HG5/82株的分離鑒定及生物學特性的研究[J].中國預防獸醫學報,2005,27(3):196-201.

[3] 霍峰,惠觀濤.應用瓊脂擴散法檢測小鵝瘟抗原抗體[J].中國獸醫雜志,2000,26(2):21-22.

[4] Karsten Hueffer.Th e natu ral host range shift and sub sequent evolu tion of canin e parvovirus resulted from viru s-specific binding to the canine transfer in receptor[J].Journalof Virology,2003,2:1718-1726.