禽腺病毒家禽分離株的生物學特性

張明明,王小輝,秦愛建

(揚州大學獸醫學院,江蘇揚州225009)

禽腺病毒(fowl adenovirus,FAV)屬腺病毒科(Adenoviridae),是雞、鴨、鵝等禽類常見的傳染性病原體之一。近年來,從鸚鵡、長尾鴨、肉雞等禽類體內分離到了多種新的血清型FAV,某些病毒株還發生了變異[1-3]。陳溥言提出雞胚致死孤兒病毒(chicken embryo lethal orphan virus,CELOV)已污染我國研究用和疫苗生產用非免疫雞胚[4]。最近,周斌等用隨機引物PCR方法從鴨肝炎病毒雞胚尿囊液種毒中擴增出了污染的CELOV DNA片段,證實了這種污染的嚴重性[5]。本試驗通過血凝試驗、電鏡技術、細胞病變以及動物試驗等方法,研究了3株不同禽源的FAV分離株的病毒特性、形態特征和致病特點等,以期為了解其致病性和研制FAV基因工程疫苗提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料 FAV分離株FAVI-C4-YZ0605、FAVI-D4-YZ0605和FAVI-G24-YZ0605分別采自江蘇省揚州市活禽市場外表健康的雞群、鴨群和鵝群,其分離、鑒定和雞胚擴增由江蘇省動物預防醫學重點實驗室完成。SPF雞胚購自山東省無特定病原種雞場,由江蘇省動物預防醫學重點實驗室孵化至使用日齡。1日齡SPF雞購自中牧集團南京藥械廠。雞胚成纖維細胞(CEF)和雞胚腎細胞(CEK)生長所需的基礎培養基DMEM購自Gibco公司。透射電鏡由揚州大學測試中心提供。

1.2 病毒形態觀察 FAV雞胚尿囊液中加入1/10體積的氯仿,充分混勻,3 000 r/min離心5 min后,吸取上清,重復此步驟直至分層之間無白色沉淀。然后將上清裝入透析袋中,外層包裹 PEG-6 000濃縮至一定體積后,收集到指形管中,加入1/10體積的氯仿繼續抽提直至分層之間無白色沉淀。取少量上清,負染后,透射電鏡觀察病毒的形態結構。

1.3 細胞致病性試驗 常規方法制備CEK或CEF單層細胞。用 DMEM 培養基1∶100稀釋FAV尿囊液,將0.2 mL病毒稀釋液分別接種24孔細胞培養板上的CEK或CEF單層細胞,同時設未接種對照。37℃5%CO2培養箱吸附2 h后,棄去病毒吸附液,補加含1%新生牛血清的DMEM,繼續培養5 d,每天于倒置顯微鏡下觀察細胞病變。吸取接種CEF的病毒上清,重新接種新鮮的CEF細胞,按上述方法連續傳5代。

1.4 雞胚致病性試驗 分別將0.2 mL FAV尿囊液通過絨毛尿囊腔接種9日齡SPF雞胚,置37℃溫箱孵育5～6 d后收獲尿囊液。通過此方法連續傳代以提高病毒滴度,同時觀察病毒對雞胚生長的影響及其致病性。

1.5 雞體致病性試驗 FAVI-G24-0605株尿囊液TCID50的測定參照文獻[6]進行。以每只雞1.0×1010TCID50的劑量,分別通過皮下和口服2種途徑各接種于10只1日齡SPF雞,并設生理鹽水陰性對照。接種后,每天觀察雞只的表現,并分別于10日齡、20日齡和30日齡各取2只不同接種途徑的小雞,稱量活體重,剖殺后取胸腺、腔上囊、脾等免疫器官稱重,并取心、肝、肺、腎、腔上囊等器官制作病理切片,觀察組織病變情況。

2 結果

2.1 病毒形態 經透射電鏡觀察FAV分離株,可以觀察到球形、無囊膜、直徑為70～80 nm的病毒粒子,具有腺病毒典型的二十面體結構,符合腺病毒的形態特征。圖1為FAVI-G24-0605分離株在電鏡下的形態。

圖1 禽腺病毒FAVI-G24-YZ0605分離株的電鏡形態A：13 000 ×;B：19 000 ×

2.2 FAV分離株在CEK和CEF上的細胞病變FAVI-C4-YZ0605、FAVI-D4-YZ0605 和 FAVI-G24-YZ0605均不能引起CEF細胞的眼觀病變,細胞生長良好;在接種24 h左右,CEK細胞開始出現細胞病變,表現為細胞變圓、聚集、折光性增強等,對照CEK細胞則看不到類似的細胞病變,只有少量因衰老或制備原因而死亡的細胞碎片(見前插彩版圖2)。

2.3 FAV分離株對雞胚的致病性 雞胚接種病毒后,未見出血等眼觀病變,也未造成雞胚生長發育遲緩。在雞胚上進行病毒擴增時,P1代和P2代病毒的滴度下降,盲傳3代后,重新檢測到病毒。

2.4 FAV分離株對SPF雞的致病性

2.4.1 FAV分離株對雞體生長發育和免疫器官的影響 在10日齡時,攻毒組的雞只平均體重均明顯輕于對照組;在20日齡和30日齡時,攻毒組和健康對照組的雞只平均體重無明顯差異(表1)。通過比較主要免疫器官的重量,發現10日齡攻毒組雞只的各免疫器官的平均重量略低于對照組;在20日齡和30日齡時,各組雞只免疫器官的重量基本一致。

2.4.2 FAV分離株對SPF雞的致病性 試驗過程中,未發現試驗雞有明顯的臨床癥狀。組織病理切片結果(見前插彩版圖3)表明,10日齡攻毒組雞只的肝組織結構完整,肝索腫脹,肝血竇變得狹窄,甚至閉塞,肝細胞渾濁腫脹,部分細胞發生水泡變性或空泡化,對照組雞只肝組織正常;20日齡后,肝、腎、腔上囊、心和肺的組織結構均正常。

表1 不同攻毒組SPF雞在不同日齡的活重和免疫器官重量 (g)

3 討論

傳統上,根據血清型差異將FAV分為3個亞群,不同亞群FAV凝集動物紅細胞的特性不同。本試驗中,3株FAV分離株均不能凝集雞紅細胞,與I群FAV不能凝集禽類紅細胞的特征一致,是否凝集其他動物的紅細胞有待進一步補充。多數FAV可以在CEK或CEF細胞上增殖,也可以經卵黃囊、絨毛尿囊膜或尿囊腔接種雞胚進行增殖,部分毒株可以引起雞胚病變。本試驗中,3株FAV分離株均不能引起CEF的細胞病變,而在CEK上可以引起典型的FAV細胞病變,表現為細胞變圓,聚集成葡萄串狀,折光性增強,嚴重時細胞脫落。通過雞胚接種,可以分離Ⅰ群FAV,但是不易分離到Ⅱ群和Ⅲ群FAV。Ⅰ群FAV通常引起雞胚充血或出血、發育不良、胚體蜷曲、不同程度的肝炎和脾腫大等。本試驗中,3株FAV分離株對雞胚沒有明顯的致病作用,這與多數Ⅰ群FAV分離株的特性不完全一致。此外,雞胚擴增病毒時,前1～2代的病毒滴度下降,某些病毒株在前3代甚至檢測不到病毒,盲傳后才重新檢測到病毒,推測這可能是病毒初次分離時不適應雞胚所致。

多數FAV分離株在禽體內復制卻不致病或僅引起輕微的病癥,當有其他誘因或是發生混合感染時,也可能影響禽群健康。研究表明,注射 Ⅰ群FAV可能致死1日齡雞,而對10日齡雞不具有致死性[7]。本試驗通過大劑量皮下注射和口服2種途徑接種1日齡SPF雞,試驗雞在感染FAV后,未出現明顯的臨床癥狀。在10日齡時,皮下注射和口服攻毒的小雞體重均明顯輕于對照組,而在20日齡和30日齡時,各組體重沒有明顯的差異,這表明FAVI-G24-YZ0605分離株對SPF雞體重影響不大,呈一過性。

某些腺病毒毒株感染可能引起免疫器官的變化,導致了腔上囊、胸腺和脾中的淋巴細胞發生嚴重的退行性變化,引起免疫損傷[8]。本試驗中,10日齡攻毒組雞只的主要免疫器官重量略低于對照組;在試驗后期,各組免疫器官的重量基本一致。組織病理學切片觀察結果表明,除部分器官有輕微病變,大部分器官基本沒有病變,后期各組織器官均正常。這表明FAVI-G24-YZ0605沒有明顯抑制免疫器官的生長,僅是一過性的變化,也不引起可見的病理損傷。由體內外試驗可知,FAV分離株的致病性低,生物安全性高,可能是較好的FAV載體。

雖然在1日齡可以分離到腺病毒,但通常在3周齡以后排出病毒,糞便中的病毒滴度較高。本試驗中,采集了不同時期的棉拭子,對雞體的排毒情況尚需檢測。此外,禽類被感染后迅速產生中和抗體,可以在1周齡時檢測到抗體,3周齡時抗體水平達到最高峰[9]。因此,攻毒后機體的抗體水平也是需要進一步檢測的項目。

[1] Raue R,Gerlach H,Müller H.Phylogenetic analysis of the hexon loop 1 region of an adenovirus from psittacine birds supports the existence of a new psittacine adenovirus(PsAdV)[J].Arch Virol,2005,150(10)：1933-1943.

[2] Hollmén T E,Franson J C,Flint P L,et al.An adenovirus link ed to mortality and disease in long-tailed ducks(Clangula hyemalis)in Alaska[J].Avian Dis,2003,47(4)：1434-1440.

[3] Guy J S,Barnes H J,Smith L,et al.Partial characterization of an adenovirus-like virus isolated from broiler chick ens with transmissible viral proventriculitis[J].Avian Dis,2005,49(3)：344-351.

[4] 陳溥言.禽腺病毒1型(雞胚致死孤兒病毒)在非免疫雞胚中隱性感染可能己經嚴重危害到我國疫苗生產[J].畜牧與獸醫,2002,34(6)：19.

[5] 周斌,曹瑞兵,盧銀華,等.隨機引物PCR擴增雞胚致死孤兒病毒DNA的研究[J].中國病毒學,2003,18(2)：137-140.

[6] 殷震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社,1997：329-331.

[7] Cook J.Pathogenicity of avian adenovirus for day-old chicks[J].J Comp Pathol,1974,84：505-515.

[8] Schonewille E,Singh A,G?bel T W,et al.Fowl adenovirus(FAdV)serotype 4 causes depletion of B and T cellsin lymphoid organs in specific pathogen-free chickens following experimental infection[J].Vet Immunol Immunopathol,2008,121(1-2)：130-139.

[9] Yates V J,Rhee Y O,Fry D E.Serological response of chickens exposed to a type 1 avian adenovirus alone or in combination with the adeno-associated virus[J].Avian Dis,1977,21(3)：408-414.