母豬群發性晚產死胎病因分析

周玉龍,石忠鵬,耿 晶,陳永松,呂其林,劉 輝,張曉磊,吳 凌,樸范澤

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院,黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江省嫩江縣九三分局山河農場獸醫院,黑龍江 嫩江 161421)

黑龍江省肇東市某豬場存欄生產母豬50頭,于2009年10月,同期生產的15頭母豬均出現產期滯后2～3 d,產死胎。母豬未見任何異常癥狀,而且死亡的胎兒也未見木乃伊化以及畸形等病理變化,但是剖檢時發現流產胎兒心臟、脾臟、腎臟和膀胱黏膜等器官有散在的出血點。為了確診該豬群暴發流產的病因,我們進行了常規的細菌學檢驗,而且應用PCR方法對常見的能夠引起母豬發生流產的豬瘟病毒(CSFV)、呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)和細小病毒(PPV)進行了檢測,結果確診豬瘟病毒是引起本次發病的主要原因,關于繁殖障礙型豬瘟引起豬群發生全部以晚產為特征的病例報道極少,因此本研究對豬瘟的臨床診斷具有重要的借鑒意義,我們將有關試驗報告如下。

1 材料

1.1 主要試劑與培養基 T rizol(Invitrogen),AMV反轉錄酶和Taq DNA聚合酶(MBI),RNase Inhibitor、dN TP 和 DL-2000 Marker(TaKaRa)。按常規方法制備血液營養瓊脂培養基[1]。

表1 CSFV、PRRSV、PPV和PRV的PCR檢測引物

1.2 引物 參照已有的研究報道合成特異性的CSFV、PRRSV、PPV和PRV 寡核苷酸引物,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 病料 無菌采取發病母豬新流產的胎兒肝臟、脾臟、肺臟和淋巴結,置-70℃備用。

2 方法

2.1 細菌的分離鑒定 將無菌采集的流產胎兒肝臟、脾臟和肺臟分別接種到含有新鮮的5%綿羊血液營養瓊脂培養基,進行常規細菌分離培養(需氧培養和厭氧培養)[1]。

2.2 病毒檢測

2.2.1 CSFV和PRRSV檢測

2.2.1.1 組織總RNA提取 取約200 mg脾臟、肺臟和淋巴結分別在研缽中加入液氮研磨,按照1 m L T rizol/100 mg組織,按產品說明書進行RNA的提取,提取的RNA置核酸真空濃縮儀內10 min,烘干后溶于30μL DEPC水中,放置-70℃待用。

2.2.1.2 cDNA合成與RT-PCR反應 模板RNA 10 μL,寡核苷酸 oligod T 1 μL,70℃5 min,置于冰上2 min,加入5×RT Buffer 4μL,10 mmol/L dNTPs 2 μL,40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL,混勻瞬離,37℃ 5 min后加入 5U/μL AMV Reverse T ranscriptase 1μL 42℃2.5 h,70℃10 min放于冰上待用。

PCR反應體系(25μL):Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL,25μm ol/m L引物 P1和P2各 0.5μL,5 U/μL LA Taq DNA 聚合酶 0.125 μL,無菌去離子水 16.9μL,模板 DNA 0.5μL。

PCR反應條件:94℃預變性5 min,進行30個循環(94 ℃30 s、50 ℃40 s、72 ℃1 min),72 ℃延伸10 min,最后降溫至4℃結束[2]。

2.2.2 PPV和PRV的檢測 按照常規方法從采集的病料肝臟、肺臟和淋巴結中提取組織DNA[4]。以提取的組織 DNA為模板,按照文獻報道進行PPV和PRV的雙重PCR擴增。反應體系為25 μL,反應程序為:94℃預變性10 min,進行30個循環(94 ℃40 s、55℃40 s、72 ℃1 min),72 ℃延伸10 min[3]。

3 結果

3.1 細菌分離結果 在需氧、厭氧和微需氧條件下,從流產胎兒的肝臟、脾臟和肺臟內均未分離出細菌。

3.2 CSFV和PRRSV檢測結果 進行RT-PCR擴增后,PCR產物用1.0%瓊脂糖進行凝膠電泳后在凝膠成像系統中觀察,可見到288 bp的基因條帶,大小與CSFV預期基因相符(見圖1)。

3.3 PPV和PRV檢測結果 將PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖進行凝膠電泳,結果未見到目的基因條帶出現。

4 小結與討論

根據流行病學特點、臨床癥狀、剖檢病變,以及應用RT-PCR檢測到288 bp的CSFV基因片段,最終確診該豬群暴發的流產是由CSFV引起的。

圖1 RT-PCR擴增結果

近些年,關于豬群發生慢性豬瘟的報道越來越多,能夠引起慢性豬瘟的原因比較多,像豬瘟疫苗劑量應用不當及對豬瘟疫苗運輸、保存、注射操作、疫苗稀釋劑使用等方面的不規范,疫苗質量下降或失效;免疫抑制疫病干擾豬群,感染有藍耳病、圓環病毒病、偽狂犬病、喘氣病等疾病,或是使用了霉變劣質飼料,使機體免疫系統受到破壞,免疫力下降,即便使用豬瘟苗也難以起到完全保護作用[5];消毒防疫意識淡薄,豬群中有持續感染的帶毒母豬長期散毒,為豬瘟病毒繁殖與傳播提供了機會[6];不實行全進全出制度,對購入的豬苗的健康背景不明,易造成豬瘟交叉感染,同時發現病豬不及時隔離消毒,給豬瘟傳播提供便利。除了上述原因以外,另一個不容忽視的原因是豬瘟免疫程序不合理,免疫過頻時,體內仍有高水平的抗體時就接種而發生中和,其次免疫密度過低,一般豬瘟疫苗接種必須半年1次[7]。該豬場是2006年建立,最初在母豬產后7 d接種豬瘟疫苗,自2009年起,免疫程序更改為母豬產后30 d接種豬瘟疫苗(與仔豬同期免疫),現在主要是更改免疫程序的母豬發生流產,因此推斷該豬場發生慢性豬瘟流產的原因可能是更改免疫程序后造成免疫紊亂所致。可見,對于豬瘟的預防應該在科學的抗體監測基礎上,制定合理的免疫程序至關重要。

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