中西藥復(fù)方制劑"復(fù)方龍膽散"防治青蛙肝炎和腹水癥的研究

王康文

（海南省屯昌縣畜牧獸醫(yī)局，屯昌 571600）

泰國虎紋蛙，原產(chǎn)于泰國，是繼美國青蛙之后引進(jìn)的又一新的食用蛙品種，又名泰國青蛙，俗稱泥蛙、田雞、田蛙、水雞等，屬兩棲綱、無尾目、蛙科[1]。海南自1997年從泰國引種虎紋蛙以來，虎紋蛙的人工養(yǎng)殖迅速發(fā)展，現(xiàn)在已成為一個(gè)較大的產(chǎn)業(yè)。不過，隨著海南虎紋蛙養(yǎng)殖不斷發(fā)展，相關(guān)病害也越來越多，其中，由嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌引起的肝炎和腹水癥病癥尤為嚴(yán)重。該蛙病呈爆發(fā)性，來勢迅猛，正常進(jìn)食的病蛙，一旦出現(xiàn)少數(shù)蛙死之后，在短短幾天內(nèi)，全池蛙死亡率可達(dá)60%以上，是一種惡性傳染病，危害極大，給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。由于從不同水體或同一水體不同時(shí)間分離到的病原菌對藥物敏感性有一定差異，治療難度較大。為了探討防治肝炎和腹水癥合適藥物，我們根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)篩選了系列對該病的病原有效治療的藥物，并對有關(guān)防治方法進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料的來源

1.1.1 患病虎紋蛙

由海南文昌市大致坡鎮(zhèn)、瓊海市長坡鎮(zhèn)、湖南等蛙場提供的患有腹水和肝炎癥的病蛙一批。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

解剖剪刀、酒精燈、固定木板、鐵釘、手套、接種玻璃棒、接種鐵絲、平板、培養(yǎng)基等。

1.1.3 培養(yǎng)基制備

先將高壓滅菌過的空燒瓶中加入所要配制總量的50%左右的水，分別稱取牛肉膏3g、蛋白胨5g、瓊脂粉7g、酵母浸膏1g，然后用玻璃棒攪勻，再加熱溶解，定容。用1/10的NaOH調(diào)PH，用PH紙對照PH值為7.2，培養(yǎng)基即可使用，待降溫后放入冰箱低溫保存待用。

1.1.4 中西藥復(fù)方制劑

以龍膽、黃芩、甘草、柴胡等中藥材，并輔以抗菌藥物諾氟沙星和抗應(yīng)激劑維生素C等為基礎(chǔ)組方的護(hù)肝方劑“復(fù)方龍膽散”。用于保肝、護(hù)肝、殺菌和防治肝炎和腹水癥疾病。精選以上中藥材料經(jīng)粉碎，過80目篩，加入諾氟沙星等復(fù)配制備。

1.1.5 標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片

北京天壇藥物生技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號為20060203。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原的接種培養(yǎng)[2]

（1）腹水癥的病原接種 把培養(yǎng)基等所用器材準(zhǔn)備好，將蛙固定在木板上，用剪刀將病蛙腹部皮膚剪開（在每次使用剪刀或者其他金屬器材前都將之放在火焰上微燒消毒），用接種鐵絲輕沾腹部流出的液體然后輕輕地涂在培養(yǎng)基表面上，做好記錄放入恒溫箱中恒溫（37.5℃）24小時(shí)后觀察病菌生長情況。（2）肝炎病原的接種培養(yǎng) 用剪刀把腹部皮膚完全剪開，用小剪刀把肝剪開一個(gè)小口，將接種鐵絲插入剪開的小口中，沾住肝中的黏液涂在培養(yǎng)基上并作好記號，放入恒箱培養(yǎng)24小時(shí)后觀察。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

1.2.2.1 抗菌素紙片的制備

（1）將質(zhì)量較好的濾紙用打孔機(jī)打成直徑60mm的圓片，每100片放入一瓶中，高壓滅菌（1.02kg30min）后在60攝氏度條件下烘干。

（2）用無菌操作法將待測的抗菌藥物溶液1ml，加入100片紙片中，置冰箱內(nèi)浸泡1-2h，立即試驗(yàn)可不烘干，若保存?zhèn)溆每捎孟铝蟹椒ê娓桑ǜ稍锏目咕丶埰杀４?個(gè)月）①培養(yǎng)烘干法：將浸泡有抗菌藥液的紙片攤平在培養(yǎng)皿中，于37℃箱內(nèi)保持2-3h即可干燥，或放在無菌室內(nèi)過夜干燥。②真空抽干法：將放有抗菌藥物紙片的試管，置于燥管內(nèi)，用真空抽氣機(jī)抽干。將制好的各種藥物紙片裝入無菌小瓶中，置冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩２⒂脴?biāo)準(zhǔn)敏感菌株作敏感性試驗(yàn)，記錄抑菌圈的直徑，若抑菌圈的的比標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株的原來縮小，則表該抗菌藥物已失效，不能再用。

1.2.2.2 藥敏試驗(yàn)操作

（1）用培養(yǎng)16-24h血平板上的菌落接種于生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。

（2）用無菌棉拭子蘸取少量的菌液，在M-H瓊脂表面均勻涂抹接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最好沿平板內(nèi)緣涂抹一周。

（3）將接種的平板置室溫下干燥3-5分鐘后，用無菌鑷子取含藥紙片緊貼于瓊脂表面，紙片中心相距應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm，置35攝氏度培養(yǎng)16-18h后觀察結(jié)果。

（4）24小時(shí)后取出所接種的病原觀察，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細(xì)菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈一般抑菌圈是接近圓形的，抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory，MIC）呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大MIC愈小。

2 虎紋蛙肝炎和腹水癥的病原及發(fā)病流行特點(diǎn)

2.1 虎紋蛙肝炎 是由于感染嗜水氣單胞菌發(fā)病，不同規(guī)格的蛙均可發(fā)生，其特點(diǎn)是發(fā)病快，傳染性強(qiáng)，死亡率高，危害大。一般發(fā)生在春末、初夏和秋末，水溫15-30℃。該病主要癥狀是：病蛙外觀呈肥胖感，雙腿粗大，呈極淡紅色，手壓則有硬肌肉感，幼蛙皮膚在不同部位有潰瘍?nèi)睋p，形狀不規(guī)則，若氣溫較低，潰瘍處加大，甚至有肌肉腐爛狀。有的個(gè)體前后肢均有淡紅色出血感，解剖內(nèi)臟發(fā)現(xiàn)，該病主要的病變在肝臟。肝異常腫大，可達(dá)正常肝的2倍左右，呈灰白色，膽腫大呈淺綠色，胃腸表面血管部分或全部充血，胃腸壁表面部分或全部充血發(fā)紅，胃腸內(nèi)有或無食物，具淡黃色黏膜。

2.2 虎紋蛙腹水癥 是由于感染遲鈍愛德華氏菌發(fā)病。癥狀：蛙傳染性肝病，簡稱“肝病”，也有的稱為大肚子病、鼓脹病、水腫病。發(fā)病時(shí)，病蛙精神不振，不攝食物，腹部膨脹、腫氣，后肢股部皮膚大塊狀充血，有的腹部兩前肢間出血，有數(shù)個(gè)小的血疙瘩，有的外表完好，不呈現(xiàn)任何特別明顯的傷口；有腹水，肝腫大，有的充血，有的有白色點(diǎn)狀壞死灶。胃壁樹枝狀充血，腸道充血，脾腫大，暗紅。發(fā)病蛙數(shù)日若得不到及時(shí)治療，將很快死亡。

2.3 危害程度：不論幼蛙或成蛙均可發(fā)生傳染性肝炎和腹水癥，嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌兩種病原同時(shí)感染發(fā)病，前期肝炎為主，后期腹水嚴(yán)重，難于治療，死亡率高達(dá)60%左右，且傳染性很強(qiáng)，一個(gè)養(yǎng)殖池中有蛙發(fā)病，若不及時(shí)撈出，采取積極措施，往往導(dǎo)致整池蛙都發(fā)病。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果 觀察的結(jié)果如下表1、表2所示，抑菌圈用直徑/mm，敏感性用“-”“+”符號表示

表1 不同藥物對虎紋蛙腹水癥病原的抗菌活性

表2 不同藥物對虎紋蛙肝炎病原的抗菌活性

3.2 討論

3.2.1 虎紋蛙肝炎的剖檢與藥敏

從疑似病蛙解剖看到，虎紋蛙肝炎外觀癥狀不明顯，一旦發(fā)病，四肢無力，肌肉癱軟如一團(tuán)稀泥，口腔有含血絲黏液吐出，并常伴有舌頭從口腔中吐出的現(xiàn)象。肝臟嚴(yán)重變色，或失色呈灰白色或土黃色，膽囊也腫大呈現(xiàn)淺綠色，胃腸充血明顯。腎臟有時(shí)也充充血腫脹。從發(fā)病到死亡一般為2～3天。死亡率極高。幼蛙發(fā)病后體表有不規(guī)則的潰瘍斑，四肢及腹部皮膚充血呈深紅色，肌肉呈現(xiàn)淡黃綠色。肝臟異常腫大，肝臟顏色呈灰白色，或嚴(yán)重充血呈墨綠色。膽汁濃，墨綠色。腸胃內(nèi)無食物，時(shí)有腸段套進(jìn)胃[3]。通過藥物抗菌活性研究，阿米卡星，頭孢曲松鈉，氯霉素和“復(fù)方龍膽散”呈高度敏感（+++）；萬古霉素呈中度敏感（+++），其他藥物均低敏感或無敏感。

3.2.2 虎紋蛙腹水癥的剖檢與藥敏

從疑似病蛙解剖看到，癥狀表現(xiàn)為腹水明顯，腹部表面似有透明斑或斑點(diǎn)狀出血；眼球時(shí)有充血，腹水也是困擾人工養(yǎng)殖戶的一個(gè)重大問題之一 [4]，治療過程長，而腹水難于消除，死亡率也很高，更主要的是蛙的耐藥性越來越強(qiáng)，通過實(shí)驗(yàn)分析，阿米卡星，頭孢曲松鈉、“復(fù)方龍膽散”呈高敏（+++）頭孢拉定呈中度敏感（++）；其他藥物低敏感或無敏感。

3.2.3 臨床治療結(jié)果

從蛙湯送來疑似病蛙，經(jīng)剖解初步判斷為肝炎和腹水癥，選用“復(fù)方龍膽散”進(jìn)行混料投服，2次/日，用藥三天能控制病情，5-7天基本治愈或轉(zhuǎn)好。用中西藥復(fù)方制劑進(jìn)行治療疑似病蛙11例，其中用8例治愈，2例好轉(zhuǎn)，1例沒有效果。

3.2.4 虎紋蛙肝炎和腹水癥的防治措施

肝炎和腹水癥由于其主要病變在肝、腎臟，中、后期病蛙造成水腫、腹水嚴(yán)重，治療難度大，應(yīng)以預(yù)防及早期治療為主。

預(yù)防措施[5]：

（1）不喂變質(zhì)的飼料，控制飼料中蛋白質(zhì)含量，避免蛙體氨中毒，而造成肝腎的損害。（2）不長期過量使用磺胺、紅霉素、鏈霉素等類藥物，影響肝、腎代謝功能。（3）定期在飼料中添加護(hù)肝類中藥制劑，檸檬酸鈉制劑消除腎腫，保護(hù)肝腎功能。（4）控制水質(zhì)，定期消毒。

治療措施：[6]

該病的治療以內(nèi)服藥和外用藥聯(lián)合使用效果最好。

外用藥：選用溴氯海因，聚維酮碘溶液、葵甲溴銨溶液任一種進(jìn)行全池遍灑或沿食臺進(jìn)行區(qū)域潑灑。

口服藥：選用“復(fù)方龍膽散”進(jìn)行混料投服，2次/日，連用5天。

本研究表明，抗菌藥物阿米卡星、頭孢曲松鈉、氯霉素、諾氟沙星和“復(fù)方龍膽散”對嗜水氣單胞菌呈高度敏感（+++），均可用于防治蛙的肝炎和腹水癥，但由于阿米卡星、頭孢曲松鈉、氯霉素在水產(chǎn)動物中禁用，“復(fù)方龍膽散”既具有高敏的抗菌活性，而又能保肝、護(hù)肝，利于后期的恢復(fù)治療。經(jīng)臨床試驗(yàn)，療效確實(shí)。故可推薦中西藥復(fù)方制劑“復(fù)方龍膽散”做為最佳選擇藥物。

[1]葉雪平.病蛙的診斷與防治技術(shù)（四）[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，1999，26（4）：183-184。

[2]中國科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類組。一般細(xì)菌常用鑒定方法[M]，北京：科學(xué)出版社，1978。

[3]賀路，艾曉輝，左文功.牛蛙腹水病病原研究[J]淡水漁業(yè)，1995，（03）

[4]葛艷，陳懷青，陸承平.遲緩愛德華氏菌胞外產(chǎn)物的細(xì)胞毒性和動物致病性[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，（01）。

[5]李義.名特水產(chǎn)動物疾病診治[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999。

[6]阮新艷，阮洪，阮敏.虎紋蛙生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)的初步研究[J]福建水產(chǎn)，1994（1）：24-28。