奧硝唑氯己定洗劑微生物限度檢查的方法學驗證

朱慶玲，黃海潮，葉娟，陳穎(廣東食品藥品職業學院，廣州市510520)

奧硝唑氯己定洗劑為廣東食品藥品職業學院研制的新型復方制劑，用于細菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎和霉菌性陰道炎的治療。該制劑中奧硝唑是第3代硝咪唑類衍生物，與甲硝唑相比，是一種療效更高、療程更短、耐受性更好的強力抗厭氧菌藥物，其對于細菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎和霉菌性陰道炎的療效優于甲硝唑及替硝唑[1，2]；處方中另一有效成分醋酸氯己定則是廣譜抗菌消毒藥[3]，具有較強的抗菌作用，2藥合用療效更為顯著；此外制劑處方中加有山梨酸鉀作為防腐劑。在研制過程中，筆者采用常規法進行微生物限度檢查時，發現奧硝唑、氯己定和山梨酸鉀的抑菌作用較強，不能消除其干擾，所以需要選擇合適的方法。經查閱文獻[4]，發現這3種成分的水溶性較好，故認為采用薄膜過濾法過濾時抑菌成分可通過濾膜[5]，而細菌被截留。決定根據0.22 μm濾膜可截留細菌的特性，選用薄膜過濾法來進行本品種的微生物限度檢查。

根據《中國藥典》2005年版(二部)附錄ⅪJ微生物限度檢查法[4]，筆者對薄膜過濾法用于奧硝唑氯己定洗劑微生物限度檢查進行了方法學驗證。

1 材料

LX-B75L型高壓滅菌鍋(合肥華泰醫療設備有限公司)；LRH-150型恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)；SHP-070型生化培養箱(上海實驗儀器廠)；HWS-24型恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；MSC-Advantage1.2生物安全柜(美國Thermo公司)；0.22 μm醋酸纖維素微孔濾膜(直徑:50 mm，上海新亞凈化器件廠)。

奧硝唑氯己定洗劑(自制，批號:20090501，規格:醋酸氯己定1.2 mg·mL－1、奧硝唑0.2 mg·mL－1)；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(自制，批號:20090501)；0.9%無菌氯化鈉溶液(自制，批號:20090501)。

營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖增菌培養基、改良馬丁瓊脂培養基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(廣東環凱微生物科技有限公司)。

大腸埃希菌(ATCC8739)、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌(ATCC9027)、白色念珠菌(ATCC10231)、黑曲霉(ATCC16404)，均購自廣東微生物菌種保藏中心。

2 方法與結果

2.1 菌懸液制備

2.1.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌懸液。取3種菌的新鮮斜面培養物接種環置于10 mL營養肉湯培養基中，35℃培養18～24 h后取新鮮培養物1 mL加入9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10－5～10－7，使成50～100 cfu·mL－1的菌懸液，備用。取白色念珠菌的新鮮斜面培養物接種環至10 mL改良馬丁培養基中，經25℃培養18～24 h后取新鮮培養物1 mL加入9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10－4～10－6，使為50～100 cfu·mL－1的菌懸液，備用。

2.1.2 黑曲霉懸液。取經改良馬丁瓊脂斜面培養基25℃培養1周的黑曲霉斜面培養物，加0.9%無菌氯化鈉溶液l0 mL，將孢子洗脫，吸出孢子懸液，用墊有脫脂棉的漏斗(濕熱滅菌)過濾，除去菌絲，收集孢子懸液至另一無菌試管內作為菌原液，取此孢子懸液1 mL加入9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，稀釋至10－4～10－5，使成50～100 cfu·mL－1的孢子懸液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

稱取本品10 mL至無菌錐形瓶中，加入滅菌后恒溫至45℃的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，采用少量分次加入，并在加入的同時晃動錐形瓶，使供試品充分分散，充分振搖5 min，作為1∶10供試液。

2.3 微生物限度檢查方法驗證

2.3.1 試驗組。取1∶10供試液10 mL，各5份，分別置于45℃的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中搖勻，在無菌操作下加入過濾器內，減壓抽干后，用45℃氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL。其中3份在最后一次的沖洗液中分別加入1 mL大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液(約50～100 cfu·mL－1)，過濾，將濾膜菌面朝上貼于營養瓊脂培養基，倒置35℃培養48 h后取出進行菌落計數；其余2份加入1 mL白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液(約50～100 cfu·mL－1)，同法過濾，將濾膜菌面朝上貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養基，倒置于25℃培養72 h取出計數。

2.3.2 菌液組。取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌液各1 mL(約50～100 cfu·mL－1)，注入平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，倒置35℃培養48 h后取出做菌落計數。取白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液各1 mL(約50～100 cfu·mL－1)，注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，倒置于25℃培養72 h取出計數。

2.3.3 供試品對照組。取1∶10供試液10 mL 2份，分別置于45℃的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中搖勻，在無菌操作下加入過濾器內，減壓抽干后，用45℃的氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL。其中1份濾膜菌面朝上貼于營養瓊脂培養基，倒置35℃培養48 h后取出做菌落計數；另1份同法過濾，將濾膜菌面朝上貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養基，倒置于25℃培養72 h取出計數，測量樣品本底菌數。

2.3.4 稀釋劑對照組。將供試液換成稀釋劑(氯化鈉-蛋白胨緩沖液)，平行操作2張濾膜，將濾膜菌面朝上貼于培養基上，同“2.3.1”項下方法進行操作，考察稀釋劑對試驗有無干擾。

“2.3.1～2.3.4”項試驗每次平行做2個平皿并重復進行3次獨立平行試驗。

分別計算各試驗菌每次試驗回收率，回收率的計算依據《中國藥典》2005版附錄ⅪJ相關要求[4]，按照如下公式計算:

試驗組的加菌回收率%＝(試驗組平均菌落數－供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數×100%

稀釋劑對照組的加菌回收率%＝稀釋劑對照組平均菌落數/菌液組平均菌落數×100%

本制劑的微生物限度檢查法回收率結果見表1。

由表1可知，各類試驗菌的回收率均大于70%，本試驗方法不受制劑中抑菌成分的影響，可用于對制劑中細菌、霉菌、酵母菌數的檢查。

2.4 控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 供試液的制備。同“2.2”項下1∶10供試液的制備。

2.4.2 試驗組。取1∶10供試液10 mL，置于稀釋劑100 mL中搖勻，以無菌操作加入過濾器內，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗3次，每次100 mL，然后取出濾膜，加入至100 mL增菌培養基中，然后加入1 mL控制菌(10～100 cfu·mL－1)，其中金黃色葡萄球菌加入至營養肉湯增菌培養液中，銅綠假單胞菌加入至膽鹽乳糖增菌培養液中，置于35℃下培養24 h。營養肉湯增菌培養液劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，倒置于35℃下培養72 h觀察結果；膽鹽乳糖增菌培養液劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，倒置于35℃溫度下培養48 h。均平行操作2個平皿，觀察結果。

表1 微生物限度檢查法回收率結果(n＝3)Tab 1Recovery results of microbial limit test(n＝3)

2.4.3 陰性菌對照組。取1∶10供試液10 mL，置于稀釋劑100 mL中搖勻，以無菌操作加入過濾器內，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗3次，每次100 mL，然后取出濾膜，加入到100 mL增菌培養基中，然后加入1 mL大腸埃希菌(10～100 cfu·mL－1)，置于35℃下培養24 h。營養肉湯增菌培養液劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，倒置于35℃下培養72 h觀察結果；膽鹽乳糖增菌培養液劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板，倒置于35℃溫度下培養48 h。均平行操作2個平皿，觀察結果。

銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌控制菌方法驗證結果見表2。

表2 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌控制菌方法驗證結果Tab 2Validation test result of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus

由表2可知，試驗組檢出銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌，陰性菌對照組無生長，說明本試驗方法適用于該制劑中銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌的檢查。

3 討論

試驗中所用的菌株必須為標準菌株，其生物學特性應典型穩定，且所用菌株的傳代不得超過5代；試驗用的菌液最好存放在4℃下冷藏，在1個月內使用。

奧硝唑氯己定洗劑中的主藥奧硝唑和氯己定抑制細菌能力很強，同時對酵母菌和真菌也有很強抑制作用，處方中還加有其它防腐劑導致對細菌也有抑制作用，但由于這3種成分在水中溶解度很好，故采用薄膜過濾法可將抑菌成分除去。

本試驗結果表明，采用薄膜過濾法測定時，試驗中各類菌的回收率均大于70%；因其為外用制劑，故對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌進行控制菌驗證試驗，結果陰性對照組均未檢出陰性對照菌，試驗組檢出控制菌，可確定薄膜過濾法適用于奧硝唑氯己定洗劑的微生物限度檢查。

[1]盧巖，葛衛紅，談恒山，等.復方奧硝唑凝膠的研制與質量控制[J].中國藥房，2005，16(21):1630.

[2]王軍，王增壽，朱光輝，等.奧硝唑的臨床應用及不良反應[J].醫藥導報，2006，25(7):711.

[3]中華人民共和國衛生部藥政局編.中國醫院制劑規范[S].第2版.北京:中國醫藥科技出版社，1995:38.

[4]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(二部)[S].2005年版.北京:化學工業出版社，2005:附錄ⅪJ.

[5]王沁馨，周劍.雙黃連口服液微生物限度檢查法的驗證[J].中國藥房，2008，19(27):2125.