鹽酸多巴胺注射液細菌內毒素檢查方法的研究

葉青，王偉，迪麗努爾·沙比托夫(.新疆維吾爾自治區食品藥品檢驗所，烏魯木齊市830004；.新疆醫科大學第五附屬醫院，烏魯木齊市8300)

鹽酸多巴胺注射液為腎上腺素受體及多巴胺受體激動藥，臨床上主要用于抗休克。《中國藥典》2005年版二部中對鹽酸多巴胺注射液無熱原或細菌內毒素檢查項目[1]，但鹽酸多巴胺注射液作為臨床常用急救藥物，是以靜脈注射的方式進入人體，臨床靜脈用藥中細菌內毒素污染可引起發熱、寒戰、昏迷甚至死亡等副反應，美、日、歐等藥典中對靜脈注射用注射液均規定有細菌內毒素或熱原檢查項目。為了有效控制藥品中細菌內毒素的含量，確保臨床用藥的安全，筆者按照《中國藥典》2005年版二部細菌內毒素檢查法，對鹽酸多巴胺注射液進行了細菌內毒素檢查法的研究。

1 材料

電熱恒溫水浴箱(上海醫療器械七廠)；微型旋渦混合器(上海精科實業有限公司)；所使用容器和用具于250℃干烤1 h以上，備用。

細菌內毒素工作標準品(批號:2007-4，效價:每支150 EU)、細菌內毒素檢查用水(BET水，批號:w2006-12，規格:每支10 mL)均來源于中國藥品生物制品檢定所；鱟試劑(TAL，湛江安度斯生物有限公司，批號:0612062；福州新北生化工業有限公司，批號:06012012，靈敏度均為0.25 EU·mL－1，規格均為0.1 mL)；鹽酸多巴胺注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號:6E11003、6E11043、6E11059；江蘇亞邦強生藥業有限公司，批號:060310、061024、060814，規格均為20 mg·2 mL－1)。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值(L)的確定[1]

根據公式:L＝K/M，其中K為按規定的給藥途徑，人用每千克體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑為5 EU·kg－1·h－1；M為人用每千克體質量每小時最大劑量。由于本品具有劑量依賴性，作用時間的長短與用量不相關，且休克患者個體差異較大，靜滴速度和時間需根據血壓、心率、尿量等情況而定，故劑量選為20 mg，稀釋后靜滴[2]，中國人平均體質量按60 kg計，計算限值為L＝15 EU·mg－1，與《美國藥典》(USP32)中規定該藥品的L為16.67 EU·mg－1沒有明顯差異，故最終確定限值為15 EU·mg－1。

2.2 鱟試劑靈敏度復核

根據鱟試劑標示靈敏度，用BET水將細菌內毒素工作標準品制備成2倍稀釋濃度的一系列內毒素溶液:2λ、1λ、0.5λ、0.25λ。按照《中國藥典》2005年版二部[1]規定，進行鱟試劑的靈敏度復核，結果2批鱟試劑經用細菌內毒素工作標準品檢查，λc均在0.5λ～2λ范圍內，均符合規定，可用于試驗。

2.3 最大有效稀釋倍數(MVD)的確定[1]

根據公式MVD＝cL/λ，其中c為供試品溶液的濃度10 mg·mL－1，L為鹽酸多巴胺注射液的內毒素限值15 EU·mg－1，λ為鱟試劑標示靈敏度，目前市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5～0.03 EU·mL－1之間，則對應的最大有效稀釋倍數依次為300、600、1200、2500、5000倍。

2.4 干擾預試驗[1，3]

為確定鹽酸多巴胺注射液對該方法的影響，首先進行供試品干擾預試驗。初步摸索可知鹽酸多巴胺注射液對細菌內毒素檢查有較強的抑制作用，由于鹽酸多巴胺注射液的pH值為3.0～4.5，故將樣品原液用無內毒素污染的1 mol·L－1的NaOH溶液調節pH至7.0左右(6.0～8.0范圍內)，用BET水分別稀釋至300、600、1200、2500、5000倍，將此系列濃度溶液記為供試品陰性對照管(NPC)。同時制備含有2λ濃度細菌內毒素的上述濃度溶液，記此系列溶液為供試品陽性對照管(PPC)。取靈敏度為0.25 EU·mL－1的2個不同廠家的鱟試劑，分別與上述NPC和PPC進行反應，每一濃度平行做2管，并設陽性(PC)與陰性(NC)對照。結果見表1(“+”為陽性反應結果，“-”為陰性反應結果)。

表1 干擾預試驗結果Tab 1Results of preliminary interference test

預試驗結果表明，當鹽酸多巴胺注射液稀釋至600倍時，對2個鱟試劑廠家的試劑的反應均無干擾作用，故選擇600倍作為正式干擾試驗稀釋倍數。

2.5 干擾試驗

為了最終確認是否存在干擾因素的影響，進行以下干擾試驗。取6批鹽酸多巴胺注射液分別調節pH至7.0后，用BET水分別稀釋至600倍，按《中國藥典》2005年版二部附錄中的“細菌內毒素檢查供試品干擾試驗”項進行試驗[1]，結果見表2。

表2 干擾試驗結果Tab 2Results of interference test

表2結果表明，細菌內毒素在2個系列中反應終點濃度的幾何平均值(Es、Et)在0.5λ～2λ之間，且Et/Es均在0.5～2.0范圍之內，確認供試品溶液在調節pH值后，稀釋至600倍(濃度為0.0167 mg·mL－1)對鱟試劑與細菌內毒素的凝集反應沒有干擾作用，可進行細菌內毒素檢查。

2.6 樣品細菌內毒素檢查

按《中國藥典》細菌內毒素檢查法，使用2批靈敏度為0.25 EU·mL－1的不同廠家的鱟試劑，分別對6批供試品在pH值調至7.0、濃度稀釋至0.0167 mg·mL－1后進行細菌內毒素檢查，并同時設立樣品的自身陽性對照管，細菌內毒素檢查結果見表3。

表3 6批樣品中的細菌內毒素檢查結果Tab 3Results of endotoxin detection of sample

表3結果表明，6批鹽酸多巴胺注射液可使用靈敏度為0.25 EU·mL－1的鱟試劑進行檢驗，且內毒素含量小于15 EU·mg－1。

3 討論

由于不同廠家生產的鱟試劑的抗干擾能力存在差別，為保證試驗結果的可靠性，本試驗選擇2個廠家生產的鱟試劑對樣品進行干擾試驗。結果發現，樣品對鱟試劑凝集反應的干擾性質為抑制作用，僅通過稀釋的方法不能排除干擾；因鹽酸多巴胺注射液的pH值范圍在3.0～4.5之間，超出了鱟試劑本身具有的緩沖能力，按照《中國藥典》2005年版[1]的規定，供試品溶液的pH值一般要求在6.0～8.0的范圍內，故將樣品pH值調至7.0左右，濃度稀釋至0.0167 mg·mL－1后，再使用2個廠家的鱟試劑對2個企業生產的6批樣品進行干擾試驗，結果Et/Es均在0.5～2.0范圍之內，確定樣品在有效濃度范圍內。樣品對鱟試劑與細菌內毒素的凝集反應雖有抑制性干擾作用，但可以通過調節pH值和稀釋的辦法排除。結果表明，將限值定為15 EU·mg－1時，鹽酸多巴胺注射液用細菌內毒素檢查法控制產品質量是可行的。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(二部)[S].2005年版.北京:化學工業出版社，2005:附錄85～88.

[2]統一藥品說明書及批準文號專項工作小組編.國家藥品標準化學藥說明書內容匯編[M].2002:5～101.

[3]劉春，趙毓梅.馬來酸氯苯那敏注射液的細菌內毒素檢查[J].中國藥房，2009，20(25):1990.