GC法檢測培美曲塞二鈉原料藥中4種有機溶劑殘留量

蔡東向，池秀珍(1.福建晉江市醫院藥劑科，晉江市3600；.福建泉州市藥品檢驗所，泉州市36000)

培美曲塞二鈉是抗腫瘤藥，在該原料藥的制備中使用了N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、乙醇、丙酮等有機溶劑，其中二氯甲烷和DMF為第2類溶劑，限量分別為0.06%、0.088%，乙醇和丙酮為第3類溶劑，限量均為0.5%[1]。筆者在對該藥進行分析時發現二氯甲烷和丙酮在聚乙二醇-20M(PEG-20M)毛細管柱系統下難以分離，而在二甲基聚硅氧烷(DB-1)毛細管柱系統下丙酮與乙醇難以分離，考慮到各種溶劑的限量差異，故采用對4種溶劑兩兩分別分析測定的氣相色譜(GC)法檢測4種溶劑的殘留量，結果表明所建立的方法簡單、準確、靈敏度高、重復性好。

1 儀器與試藥

GC-14B氣相色譜儀、氫火焰離子化檢測器(FID)、N-2000色譜工作站(浙江大學信息工程研究所)。

培美曲塞二鈉原料藥(北京思普潤安醫藥科技有限公司，批號:20041002、20041003、20041004，含量:98.92%、99.28%、99.06%)；二氯甲烷、DMF、四氫呋喃(THF)、無水乙醇、丙酮均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 二氯甲烷和DMF的檢查

2.1.1 色譜條件。色譜柱:DB-1石英毛細管柱(30 m×0.53 mm，1.0 μm)；柱溫:40℃；氣化室:180℃；檢測器:200℃；載氣:氮氣(N2):50 kpa，氫氣(H2):50 kpa，空氣:50 kpa；進樣量:1 μL(不分流進樣)；溶劑為水。

在上述色譜條件下，取“2.1.2”項下二氯甲烷、DMF和內標THF的混合標準溶液進樣，記錄色譜，理論板數按二氯甲烷計不得低于4000，二氯甲烷、DMF及THF兩兩之間的分離度應大于1.0。色譜見圖1A。

2.1.2 溶液的制備。(1)標準貯備液:分別精密稱取二氯甲烷60 mg、DMF 88 mg置于同一100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。(2)內標溶液:精密稱取THF 75 mg置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。(3)對照品溶液:精密量取標準貯備液及內標溶液各1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。(4)供試品溶液a:精密稱取1 g的樣品，置于10 mL容量瓶中加水溶解，加1 mL內標溶液，加水定容至刻度，搖勻，即得。

取供試品溶液a進樣，色譜見圖1B。

2.1.3 標準曲線的制備。精密量取標準貯備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，每瓶中加1 mL內標溶液，加水定容至刻度，搖勻，即得標準系列溶液。分別吸取上述標準溶液1 μL進樣(每點3次)，按“2.1.1”項下色譜條件進行分析，以待測溶劑與內標峰面積比值(Y)對濃度(X)進行回歸，計算線性方程，得二氯甲烷的回歸方程為Y＝0.0166X－0.0911(r＝0.9988)；DMF的回歸方程為Y＝0.0334X－0.1669(r＝0.9997)。結果表明，二氯甲烷、DMF的檢測濃度線性范圍分別為11.4～171、14.76～221.4 μg·mL－1。

2.1.4 檢測限。取標準曲線最低點的標準溶液，用水稀釋10倍，調整進樣量至響應信號峰高為基線的3倍，即為檢測限。測得二氯甲烷和DMF的檢測限分別為0.30、0.02 ng。

2.1.5 精密度試驗。取“2.1.3”項下的第3號溶液，精密吸取1 μL，分別進樣5次，記錄峰面積，以峰面積比值計算日內精密度，結果二氯甲烷、DMF的RSD分別為1.4%、1.9%；另取該溶液分別于3 d內進樣，以峰面積比值計算日間精密度，結果RSD分別為1.7%、2.2%。

2.1.6 回收率試驗。取已知殘留量的樣品1 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加水適量溶解，精密加入標準貯備液及內標溶液各1.00 mL，加水定容至刻度，搖勻，得樣品溶液。分別取樣品溶液及“2.1.2”項下對照品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，以峰面積按內標法計算回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果(n＝3)Tab 1Results of recovery test(n＝3)

2.1.7 樣品中二氯甲烷和DMF的殘留量測定。精密稱取1 g的樣品，置于10 mL容量瓶中加蒸餾水溶解，加1 mL內標溶液，加水定容至刻度。精密吸取1 μL進樣，記錄峰面積，結果二氯甲烷和DMF均未檢出，說明樣品符合要求。

2.2 丙酮和乙醇的檢查

2.2.1 色譜條件。色譜柱:PEG-20M石英毛細管柱(30 m×0.53 mm，1.0 μm)；柱溫:42℃；氣化室:180℃；檢測器:200℃；恒溫載氣:N2:50 kpa，氫氣:50 kpa，空氣:50 kpa；進樣量:1 μL(不分流進樣)；溶劑為水。

在上述色譜條件下，取“2.2.2”項下乙醇與丙酮的標準溶液進樣，各組分色譜峰的理論板數均不得低于3000，二者分離度應大于2.0，色譜見圖1C。

2.2.2 溶液的制備。(1)標準貯備液:精密稱取丙酮和乙醇各0.1 g置于同一100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。(2)對照品溶液:精密量取標準貯備液1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。(3)供試品溶液b:取樣品，精密稱取1 g置于10 mL容量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，即得。

取供試品溶液b進樣分析，色譜見圖1D。

2.2.3 標準曲線的制備。精密量取0.2、0.5、1、2、3 mL標準貯備液，分別置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得標準系列溶液。分別吸取上述溶液1 μL進樣(3次)分析，記錄峰面積，以各濃度點峰面積平均值(Y)對濃度(X)進行回歸，得乙醇的回歸方程為Y＝701.77X+1562.6(r＝0.9996)，丙酮的回歸方程為Y＝677.46X－997.3(r＝0.9990)。結果表明，乙醇與丙酮的檢測濃度線性范圍均為20～300 μg·mL－1。

2.2.4 檢測限。取標準曲線最低點濃度的標準溶液用水稀釋50倍進樣，調整進樣量至響應信號峰高為基線的3倍即為檢測限。按此方法測得乙醇和丙酮的檢測限分別為0.09、0.02 ng。

2.2.5 精密度試驗。取“2.2.3”項下第3號溶液，精密吸取1 μL，分別進樣5次，記錄峰面積，以峰面積計算日內精密度，結果乙醇和丙酮的RSD分別為0.4%、1.6%；另取該溶液分別于3 d內進樣，以峰面積計算日間精密度，結果分別為0.9%、1.2%。

2.2.6 回收率試驗。取已知殘留量的樣品1 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加水適量溶解，精密加入標準貯備液1.00 mL，加水定容至刻度，搖勻，得樣品溶液。分別取樣品溶液及“2.2.2”項下對照品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，以峰面積按外標法計算回收率，結果見表1。

2.2.7 樣品中乙醇和丙酮殘留量測定。分別精密吸取1 μL供試品溶液和對照品溶液進樣，記錄峰面積。結果乙醇和丙酮均未檢出。

3 討論

本品在合成過程中所用的4種有機溶劑在測定時，由于柱長有限，因而互相之間易產生干擾，如以SE-30(甲基硅橡膠)為固定液，則乙醇和丙酮不易分開；而以PEG-20M為固定液，則二氯甲烷與乙醇互相干擾。但分別測定時，則干擾可消除。考慮到DMF在PEG-20M柱上出峰較晚，故測定樣品時采用程序升溫(42℃保持3 min后，以15℃·min－1升至140℃并保持3 min)，以保證DMF完全流出色譜柱。同時該色譜體系下的測定結果也表明，在SE-30體系中保留時間5.5 min處的峰為溶劑峰，而不是樣品中的DMF殘留。結果，樣品中4種溶劑未檢出。

人用藥品注冊技術規范國際協調在關于有機溶劑殘留量的指導原則中將二氯甲烷、DMF列為第2類必須控制的毒性試劑，將乙醇、丙酮列為第3類低毒性的溶劑[2]。根據《化學藥物殘留溶劑研究的技術指導原則》[3]，本品在水中易溶，同時殘留的有機溶劑也能在水中溶解，所以采用水作為溶劑進行試驗。本試驗采用內標法測定有機溶劑的含量，可減少儀器系統或操作過程的誤差。經對多種有機溶劑的篩選，選擇THF為內標可與4種有機溶劑達到基線分離，無干擾，方法學試驗得到滿意結果，精密度也符合2010年版《中國藥典》[1]的要求(RSD＜5%)。故該法可用于測定培美曲塞二鈉原料藥中有機溶劑的殘留量，測定結果準確、可信。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(二部)[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄61～65、194.

[2]周海均主譯.藥品注冊的國際技術要求·質量部分[M].北京:人民衛生出版社，2000:79.

[3]國家藥品審評中心.化學藥物殘留溶劑研究的技術指導原則[Z].2005.