HPLC法測定山奈酚胃漂浮緩釋片中主藥含量Δ

錢一鑫，康冀川，文庭池，何，何軍(.貴州大學西南藥用生物資源教育部工程研究中心，貴陽市55005；.貴州師范學院，貴陽市55008)

近年來，中藥及其活性成分誘導腫瘤細胞凋亡的研究已成為生物醫學研究中最活躍的領域之一[1，2]。現代藥理學研究[3]表明，天然黃酮醇山奈酚(Kaempferol)對多種腫瘤細胞均有抑制作用，特別是對胃癌細胞的抑制作用方面近年來已取得較多的進展，如:山奈酚可通過下調凋亡抑制基因bcl-2表達來誘導胃癌細胞凋亡，從而發揮抑制腫瘤生長、轉移作用；山奈酚的攝入能夠降低西班牙人胃癌的發病率[4]等。山奈酚胃漂浮緩釋片是由山奈酚與適宜藥用輔料制成的親水凝膠型緩釋胃漂浮片，是針對胃癌治療而新開發的靶向制劑，該制劑可延長藥物在胃內的滯留時間，減少給藥次數，延長山奈酚的吸收，提高生物利用度和治療胃癌的靶向性。為了更好地控制產品質量，保證產品療效，本文選用高效液相色譜(HPLC)法對制劑中山奈酚的含量進行了測定，建立了分離效果好、簡便可行的含量測定方法，結果表明其可用于本品的質量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC儀，包括G1310A泵、G1316A柱溫箱、G1314A紫外檢測器、HPCORE工作站(美國Agilent公司)。

山奈酚標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110861-20080，含量:95.9%)；山奈酚原料藥(貴州省生化工程中心，批號:20080311，含量:98.7%)；山奈酚胃漂浮緩釋片(貴州省生化工程中心，批號:20080801、20080803、20080805，規格:每片25 mg)；甲醇為色譜純，醋酸為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相:甲醇-0.4%醋酸溶液(48∶52)；檢測波長:360 nm；流速:0.8 mL·min－1；柱溫:45℃；進樣量:20 μL。取“2.2”、“2.3”、“2.4”項下標準品、供試品、空白輔料溶液進樣測定，結果空白輔料對主藥測定無干擾。色譜見圖1。

2.2 標準品溶液的制備

精密稱取山奈酚標準品5.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇振搖超聲溶解，冷卻后定容，得到質量濃度為0.1 mg·mL－1的貯備液。精密量取貯備液2 mL置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，得含山奈酚為20 μg·mL－1的溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品20片，研細，取細粉適量(相當于山奈酚10 mg)，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加甲醇80 mL，超聲處理10 min使藥物溶解，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 空白輔料溶液的制備

按樣品的處方稱取相當于10 mg山奈酚的輔料，置于100 mL容量瓶中，按“2.3”項下方法制成空白輔料溶液。

2.5 線性關系考察

分別精密量取“2.2”項下制備的標準品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，以流動相稀釋并定容，搖勻，制成系列標準溶液。分別精密吸取20 μL進樣，記錄色譜峰，以峰面積(A)對其濃度(C，μg·mL－1)進行線性回歸，結果回歸方程為A＝19.705C+31.598(r＝0.9997)。結果表明，山奈酚檢測濃度線性范圍為5.0～40.0 μg·mL－1。

2.6 穩定性試驗

將上述標準品溶液(20.0 μg·mL－1)于室溫、陽光不直射的情況下放置，每隔2 h分別精密量取20 μL進樣測定1次，共測定6次，記錄峰面積，結果RSD＝2.0%，表明溶液在6 h內穩定。

2.7 精密度試驗

取同一批樣品(批號20080801)6份，分別按照“2.3”項下制備供試品溶液，進樣測定含量，結果樣品平均標示量為100.30%，RSD＝1.77%，表明本方法的精密度良好。

2.8 回收率試驗

取山奈酚原料藥，加入處方比例的輔料，用甲醇溶解，超聲處理10 min，再加甲醇稀釋至刻度，濃度范圍為含量測定濃度的80%、100%、120%，每個濃度制備3份，過濾。取續濾液按“2.9”項下方法進行測定，并計算回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果(n＝9)Tab 1Results of recovery test(n＝9)

2.9 樣品含量測定

分別取山奈酚胃漂浮緩釋片3批各20片(批號:20080801、20080803、20080805)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL進樣分析，記錄色譜；另取“2.2”項下標準品溶液，同法測定，按外標法以峰面積計算供試品的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果Tab 2Content determination of samples

3 討論

山奈酚胃漂浮緩釋片是貴州大學西南藥用生物資源教育部工程研究中心開發研究的抗胃癌新制劑，目前該產品尚未上市，故對產品質量標準進行充分的研究，將對制劑品種的穩定性和上市產品后質量監控具有十分重要的意義。試驗中測定的山奈酚胃漂浮緩釋片的凝膠骨架材料為羥丙甲基纖維素和海藻酸鈉，這2種輔料均不干擾主藥的測定。

本文通過方法學考察建立了測定山奈酚胃漂浮緩釋片含量的HPLC法，結果表明，本方法靈敏、準確、專屬性強，不但可用于控制山奈酚胃漂浮緩釋片的質量，也可用于山奈酚其它制劑的質量控制和分析。

[1]馬慧萍，謝景文.中藥誘導腫瘤細胞凋亡的研究進展[J].中國藥房，2001，12(4):242.

[2]王艷艷，王威，李紅巖.中藥有效成分抗胃癌作用研究進展[J].中國藥房，2007，18(30):2383.

[3]劉彥芳.山奈素對裸鼠原位種植人胃癌組織ki67和bcl-2表達的影響[D].第二軍醫大學，2005:38.

[4]Reina GC，Carlos AG，Antonio A，et al.In take of specific carotenoids and flavonoids and the risk of gastric cancer in Spain[J].Cancer Causes and Control，1999，10(1):71.