奧沙利鉑-碘油乳劑制備比例的試驗研究

范芳，郝明志，林海瀾#，楊琳，王勁，謝瑞祥(.福建省腫瘤醫院藥理實驗室，福州市35004；.福建省腫瘤醫院介入治療科，福州市35004)

經導管肝動脈化療栓塞術(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)是目前廣泛應用于中、晚期肝癌的治療手段，是不能手術切除肝癌的患者目前的首選治療方法[1]。碘油在肝癌的化療栓塞治療中，除具有一定的栓塞作用外，還可作為化療藥物的載體，使藥物具有一定的緩釋作用，維持化療藥物在病變局部的高濃度，發揮化療藥物的抗癌作用[2]。在肝癌的化療栓塞治療中，順鉑、阿霉素等化療藥與碘油制成的乳劑已廣泛用于肝癌的介入治療中[3，4]，但到目前為止，肝癌介入栓塞化療仍無標準方案。新藥奧沙利鉑在肝癌的化療中取得了一定療效，但其與碘油混合后的緩釋作用和物理穩定性方面的研究則未見文獻報道。本研究模擬二者臨床實際應用比例及按無菌性要求制備符合肝動脈導管注射使用的奧沙利鉑-碘油乳劑(Oxaliplatin-lipiodol emulsion)，以探討其物理化學穩定性，為進一步臨床應用提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器

GOLD系統高效液相色譜(HPLC)儀，包括125型泵和168型DAD紫外檢測器(美國Beckman公司)。

1.2 試藥

超液態碘油(Ultra-fluide lipiodol，以下簡稱碘油，法國Guerbet公司，批號:071U013A，含碘:48%)；注射用奧沙利鉑無菌粉末(批號:09041411，規格:每支50 mg)、奧沙利鉑對照品(批號:619090601，純度:99%)均由江蘇恒瑞藥業有限公司提供；5%葡萄糖注射液(5%GS，杭州民生藥業有限公司，批號:10906091，規格:每袋250 mL)；乙腈為色譜純，試驗用水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

透析袋(美國聯合碳化物公司，允許通過顆粒的分子量為8000～14000)。

2 方法與結果

2.1 奧沙利鉑濃度的測定

2.1.1 奧沙利鉑標準貯備液的制備。精密稱取奧沙利鉑對照品100.0 mg，用0.01 mol·L－1磷酸鹽緩沖液溶解后定容至100 mL，即得1 mg·mL－1奧沙利鉑標準貯備液。

2.1.2 色譜條件[5]。色譜柱為HYPERSIL ODS分析柱及預柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相:10%甲醇；流速:1 mL·min－1；檢測波長:250 nm；柱溫:室溫；進樣量:20 μL。

取“2.1.1”項下奧沙利鉑標準貯備液、“2.4”項下空白溶液(5%GS-碘油乳劑(不含奧沙利鉑)＝0.5∶5)及5%GS-碘油(0.5∶5)乳劑透析0.5 h透析液、5%GS-碘油(0.5∶5)乳劑透析24 h透析液進樣分析，色譜見圖1。

2.1.3 標準曲線的制備。準確吸取適量奧沙利鉑標準貯備液，用0.01 mol·L－1磷酸鹽緩沖液定容至10 mL，制成0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg·mL－1的系列濃度的奧沙利鉑標準溶液，依“2.1.2”項下色譜條件操作，對測得的奧沙利鉑峰面積(Y)與奧沙利鉑濃度值(X)進行回歸得標準方程:Y＝0.131X+0.085(r＝0.9999)，結果表明奧沙利鉑檢測濃度線性范圍為0.025～0.500 mg·mL－1。

2.1.4 精密度和回收率試驗。在同日內測定5次和連續5 d每天測定1次濃度為0.025、0.100、0.400 mg·mL－1的標準溶液，依標準方程計算含量，計算精密度。結果，日內RSD分別為2.27%、1.86%、1.45%；日間RSD分別為1.45%、0.61%、1.87%。

制備奧沙利鉑濃度為0.025、0.100、0.4 mg·mL－1的樣品各6份，測定后依標準方程計算出相應的分析濃度，與實際濃度相比較計算出相對回收率。結果平均相對回收率為99.90%，RSD＝1.89%。

2.1.5 穩定性試驗。將一定濃度的奧沙利鉑溶液置于37℃水浴中，分別于0、2、4、8、12、24 h取樣測定奧沙利鉑的濃度，結果RSD＝1.07%，表明奧沙利鉑溶液在測定條件下穩定。

2.2 不同比例奧沙利鉑-碘油乳劑的制備

取50 mg奧沙利鉑分別溶解于0.5、1、2、2.5 mL的5%GS中，再分別與5 mL的碘油混合后置于注射器中，用“單泵法”來回抽20次，停5 min后再抽20次，制成5%GS與碘油比例為0.5∶5、1∶5、2∶5、2.5∶5的乳劑。

2.3 物理穩定性的考察[6]

將“2.2”項下制備的乳劑置于400倍普通顯微鏡下觀察乳滴的大小及分布。在顯微鏡下可觀察到，5%GS與碘油的比例為2.5∶5的乳劑乳化不充分，乳滴大小分布不均勻，在油相中可見較多大液滴；2∶5比例的乳劑大液滴數量明顯降低，但仍可見較大直徑的液滴；1∶5比例的乳劑乳滴大小分布較均勻；0.5∶5比例的乳劑視野中未見較大直徑的液滴，乳滴大小分布更為均勻。乳劑乳滴分布越均勻表明乳化越好，故以0.5∶5比例為最佳。

將“2.2”項下制備的乳劑靜置于試管內24 h(試管置于37℃恒溫水浴鍋內)，觀察不同時間奧沙利鉑-碘油乳劑中油水分層情況，結果見表1。

表1 5%GS與碘油不同比例所制乳劑的分層時間Tab 1Stratification time of Oxaliplatin-lipiodol emulsion prepared by different proportion of 5%GS to lipiodol

由表1可見，隨著5%GS用量的增加，乳劑的穩定性下降。5%GS與碘油的比例為0.5∶5的乳劑最穩定，超過24 h未見其分層。

2.4 體外藥物釋放試驗[7]

吸取“2.2”項下制備的乳劑2 mL，分別放入透析袋中并置于含100 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 mol·L－1，pH＝7.0)的透析液的燒杯中，置于37℃恒溫水浴鍋中透析。分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h取樣0.2 mL，每次取樣后均吸取等量的新鮮磷酸鹽緩沖液加入透析液中。分析奧沙利鉑-碘油乳劑(5%GS-碘油＝0.5∶5)透析0.5 h和24 h后透析液中奧沙利鉑的色譜，見圖1c、d)，根據奧沙利鉑標準方程計算透析液中奧沙利鉑的濃度，根據公式計算出累積釋放度[釋放度＝(奧沙利鉑測得的累積溶出量/奧沙利鉑總加入量)×100%]。以不同比例的5%GS-碘油乳劑(不含奧沙利鉑)為空白溶液，將50 mg奧沙利鉑溶于5 mL的5%GS中，制成濃度為10 mg·mL－1的奧沙利鉑-5%GS溶液作為無緩釋作用的對照。

不同比例的奧沙利鉑-碘油乳劑中奧沙利鉑的釋放曲線見圖2。

圖2 不同比例的奧沙利鉑-碘油乳劑的釋放曲線Fig 2Release curves of different proportion of Oxaliplatin-lipiodol emulsion

與奧沙利鉑-5%GS水溶液相比，不同比例的碘油乳化劑均有緩釋作用。5%GS與碘油的比例為2.5∶5、2∶5時的乳劑釋放快且不穩定；相比較前兩者，比例為1∶5的乳劑緩釋作用得以提高；而比例為0.5∶5的乳劑具有優良的緩釋作用，奧沙利鉑釋放緩慢且穩定。體外釋放試驗的結果與乳滴分布及油水分層現象基本吻合。經計算，釋放到透析液中奧沙利鉑的量和透析袋中經透析后的乳劑破乳后測定的奧沙利鉑的量的總和與加入量大致相當；同時，由圖1d可見，經24 h透析后，透析液色譜上仍僅見奧沙利鉑單一的峰，未有其它雜峰，可見，奧沙利鉑在碘油-5%GS乳劑中具有穩定的物理化學性質。

3 討論

隨著栓塞劑和栓塞方法的改進，TACE已成為非手術治療肝癌的有效手段。超液態碘油由于黏度低，容易經過較細的導管注入較細小的腫瘤血管而作為化療藥物的載體，可與化療藥物制成乳劑或混懸劑，經導管注入肝動脈，可使化療藥從基質中緩慢釋放，從而改變化療藥的釋藥速度，提高化療藥在肝組織中的濃度，延長化療藥的作用時間，降低其系統毒性[7]。乳劑的乳滴大小、物理穩定性和釋放度是決定栓塞用乳劑或混懸劑療效的的重要因素。

奧沙利鉑為水溶性藥物，不溶于碘油，與碘油形成的乳劑為W/O型，隨著水相的比例增大，形成均勻乳劑越困難。水相與油相的比例降為0.5∶5時，所用的5%GS既可很好地溶解奧沙利鉑，又易與碘油形成穩定的乳劑，甚至不需采用“雙泵法”或超聲乳化，僅需“單泵法”即可，大大簡便了臨床操作。水相與油相的比例低于0.5∶5時，由于水相過少未能充分溶解奧沙利鉑反而不易操作。

在體外釋放度試驗中，由色譜可見，整個釋放過程中僅見奧沙利鉑的峰，未見其它雜峰，表明奧沙利鉑-碘油具有良好的物理化學穩定性，且具有良好的緩釋作用，因而具有臨床適用性，為肝癌的介入治療提供了一種新的栓塞化療選擇方案。

[1]Higuchi T，Kikuchi M，Okazaki M.Hepatocellular carcinoma after transcatheter hepaticarterial embolization:A histopathologic study of 84 resected cases[J].Cancer，1994，73(9):2259.

[2]晁明，蔣定堯，任志達，等.微導管在肝癌介入治療上的應用[J].實用放射學雜志，2001，17(4):247.

[3]Kamada K，Nakanishi T，Kitomoto M，et al.Long-term prognosis of patients undergoing transatheter arterial chemoembolization for unresectable hepatocellular carcinoma comparison of cispalation lipiodol supension and doxorubicin hydrochloride emulsion[J].J Vasc Interv Radionl，2001，12(7):847.

[4]Ono Y，Yoshimasn T，Ashikagak R，et al.Long-term results of lipiodol transcatheter arterial embolization with cisplation or doxorubicin for unresectable hepatocellular carcinoma[J].Am J Clin Oncol，2000，23(6):564.

[5]黃毅嵐，張嵐.HPLC法測定奧沙利鉑中有關物質的含量[J].中國藥房，2008，19(1):50.

[6]段恭寬.物理藥學[M].北京:北京醫科大學出版社，1993:393～398.

[7]Miller DL，O’Leary TJ，Girton M.Distribution of iodized oil with in the liver after hepatic arterial injection[J].Radiology，1987，162(3):849.